细胞生物学实验操作指南

细胞生物学实验操作指南目 录洗涤与灭菌细胞培育瓶小烧杯、吹管盐水瓶瓶盖、胶塞塑料器皿附注：洗液配方〔次强酸液〕配置常用溶液平衡盐溶液pH调整液抗生素液2.3.1青霉素+链霉素2.3.2两性霉素2.3.3G4182.3.4潮霉素2.4消化液2.5培育基2.5.1配置2.5.2使用培育操作根本要求无菌操作一．洗涤与灭菌在组织培育中，离体细胞对任何有害物质都格外敏感。有害物质包括微生物、细胞剩余物以及非养分成分的化学物质。因此对承受和重使用的培育器皿，都要严格清洗。细胞培育瓶：浸泡：璃器皿，玻面常带有很多枯槁的灰尘，同时在生产过程中，玻璃外表常呈碱性并带有一些对(5%)浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。培育后的玻璃器皿往往附有大量蛋白质，枯槁后不易刷洗掉，故用后要马上浸入清水中；留意让水能完全进入瓶皿中，不应留有气泡。刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般仍旧要用毛刷沾洗涤剂洗涤，以除去器皿外表的附着较牢的杂质。刷洗次数太多，能损害器皿外表光泽度，所以应选用软毛刷和优质的洗涤剂〔如高级洗衣粉或洗洁精，确定不能使用含沙粒的去污粉！洗刷时特别留意洗刷瓶角部位。可以将洗涤剂倒入浸泡培育瓶的清水中，直接在水中进展刷洗，然后再以清水冲洗干净。泡酸：器皿无腐蚀作用，去污力量很强，是清洗过程中关键的一环。浸泡时，器皿要布满洗液，勿留气泡。浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。留意，泡酸时要戴防酸手套，否则将损伤皮肤。冲洗：泡酸后必需用水充分冲洗，使之不留任何残迹。冲洗时每瓶都要用水灌满，倒掉。冲洗程2010遍，最终用双蒸水冲洗两遍。干烤：以铝铂封好瓶口，放入烘烤罐中，1602小时，完成干热灭菌方能使用。返回名目小烧杯、吹管：(1)浸泡：初次使用和培育用后的小烧杯、吹管一样需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶解掉。的玻璃器皿，同培育瓶一样用盐酸浸泡。泡酸：〔依据状况可省略这一步〕刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗烧杯壁，吹管内壁也可用极细的软毛刷刷洗。冲洗：104遍，最终用双蒸水冲洗两遍。干烤：盖上筒盖，1602小时，完成干热灭菌方能使用。盐水瓶：盐水瓶主要用于放置培育基、Versen、D-Hanks等，一般购自医院，原来已经盛放过溶液，为保证使用液的纯洁，应充分洗涤、灭菌。用过的盐水瓶先要装满水，以防内壁上的附着物枯槁；使用前倒去内容水，以洗液浸泡过夜，然后冲洗，自来水2010遍，双蒸2遍，再以铝铂包裹瓶口，外包报纸，1602小时，完成干热灭菌备用。瓶盖、胶塞：2%NaOH10~201%30分钟，最终104次，晾干，以纸包好，湿热灭菌备用。塑料器皿：目前我试验室组织培育使用的塑料器皿主要是从国外购置的，是一种无毒并已经辐照灭菌、密封包装的商品。用时，只要翻开包装即可，是一次使用性物品。必要时，用后经过无菌处理后，尚可反复使用2~3次，但不宜过多。再用时仍旧需要清洗和灭菌处理。塑料器皿质地软，不宜用毛刷刷洗，造成清洗困难。为此使用中一是防止划痕，二是用后要马上浸入水中严防附着物枯槁；如残留有附着物，可在洗液中浸泡过夜，用流水冲洗干净，再用蒸馏2小时以上，置无菌处〔如超净台〕备用。冻存管可不必用紫外线灭菌，泡酸、清洗干净后，旋上管盖〔留意不要旋紧裹后装入饭盒中湿热灭菌备用。附注：洗液配方〔次强酸液〕重铬酸钾 120g浓硫酸 200mL蒸馏水 1000mL配置时先将浓硫酸倒入蒸馏水中，边加边搅拌，再将重铬酸钾晶体溶解入。返回名目二．配置溶液全部细胞培育用液都必需以三蒸水配置，在本试验室的条件下以双蒸水配置。平衡盐溶液：PBS

(g/L)

D-HanksKCl 0.2

KClKHPOKHPO

0.2 2 42 4 NaClNaCl 8.0 NaHCONaHPO·12H0

2.08

3NaHPO·12H02 4 2

2 4 2酚 红(g/L)0.40.068.00.350.080.0210×浓度的储存液，在储存液内加少许氯仿〔2-3mL〕防腐；氯仿在高压灭菌时可挥发掉，不影响使用；加氯仿后要用力混匀，在室温或4℃储存。用时按比例稀释，塞上胶塞，胶塞上插(g/L)0.40.068.00.350.080.02pH调整液：HEPES〔238.31〕200mL47.6HEPES1NNaOHpH7.5~8.04℃1M抗生素液：培育基液内参加适量的抗生素，以预防由于操作不慎而产生的微生物污染。常用的1100×的储藏液，-20℃保存。青霉素+链霉素：取注射用青霉素钠盐粉末和注射用硫酸链霉素粉末，依据1万单位每毫升的比例用D-Hanks100×的储藏液，-20℃保存。两性霉素：15mgB50mLD-Hanks100×的储藏液，-20℃保存。留意由于两性霉素非水溶性，储藏液是浑浊的，稀释使用时可恢复澄清。〔3〕G418：G418neo1G4181mL1MHEPES10mL，过滤消毒，4℃保存。〔4〕潮霉素：用于转染带有hyg基因的载体质粒后阳性克隆的筛选。购置的潮霉素B原液为14.82mg/mL2615mg/mL，4℃保存。消化液：Versen：即EDTA溶液，对细胞有肯定的离解作用，并且毒性小，价格低廉，使用便利。配1000mLD-Hanks0.2gEDTA，高压灭菌即可，4℃储存备用。胰蛋白酶溶液〔Trypsi：胰蛋白酶主要来自牛或猪的胰脏，是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗枯燥处保存，本试验室保存于-200.25克置烧杯中，先用少100mL，NaHCO3pH至7.244℃储存备用。其主要作用是使细胞相互离散。胰蛋白酶对细胞的分别作用与细胞的类型和细胞的特征有亲热的关系，不同的细胞系对胰蛋白酶溶液的浓度、温度和作用时间等的要求也不一样。一般来讲，浓度大、温度高、作用时间越长，对细胞的分别力量也越大，但超过肯定的限度也会损伤细胞。对不同的细胞系要进展梯度尝试。培育基：细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除需无菌、温度、空气等条件外，最主要的是培育基。它是供给细胞养分和保证细胞生长增殖的物质，细胞生长在培育基中，故培育基也是细胞的生存环境。培育基的种类很多，按其性质状态，分半固体培育基〔如软琼脂培育基〕和液体培育基。液体培育基是最主要的，按其来源，则分自然培育基和合GIBCOHyClone配置〔1〕DMEM：哺乳动物细胞培育基，每包干粉可以配置1950mL3.7gNaHCO3pH到7〔用1NNaOH或1NHCl，边搅拌边参加，直至适宜的pH值，加蒸馏水补充体积到1〔1mL〕25mL37℃恒温箱中放置一星期，其余4℃保存。确定37℃中的培育基未长菌后，保存的培育基才可以使用。〔2〕RPMI1640：1950mL2gNaHCO3pH7.0〔1NNaOH1NHCl，pH1〔约1mL〕置25mL培育瓶中，将培育瓶在37℃恒温箱中放置一星期，其余4℃保存。确定37℃中的培育基未长菌后，保存的培育基才可以使用。〔3〕Grace”s：1950mL3.3g3.3gpH6.0(用1NNaOH或1NHCl，边搅拌边参加，直至适宜的pH值，加蒸馏水补充体积到1升，过滤除菌，取出小量〔约1mL〕25mL培育瓶中，将培育瓶在37℃恒温箱中放置一星期，4℃37℃中的培育基未长菌后，保存的培育基才可以使用。使用配置完全培育基合成培育基〔无血清培育基，serumfreemedium，SFM〕使用前应参加血清，以供给足够的养分。细胞培育用血清常用的有胎牛血清〔fetalbovineserum,FBS〕和小牛血清(calfserum/bovineserum,CS/BS)，假设针对培育细胞的物种来源选择同种动物的血清对细胞更有利，但由于价格、个体差异、易污染等缘由而不行能。使用进口的胎牛血清可以保证无支原体的污染，且小牛血清中可能含有哺乳后生物活性物质的污染，质量不如胎牛血清，因此本试验室目前根本上使用胎牛血清。参加血清的浓度依试验要5%-20%10%的，为掌握细胞的生长速度，可以降低血清的浓度到5%，细胞生长状况不佳时可以将血清浓度提高到15%，20%血清浓度的培育基一般只在转染时使用。菌，可以不加抗生素，不过在当前试验条件下还是提倡参加抗生素),参加抗生素的比例1:100，100mL1mL100×)。一般一次配置适量的完全培育基(50-100mL)，以减小和避开由可能发生的污染而引起的损失。附注：常用抗生素用量和效应抗生素使用浓度作用对象G100U/ml革兰氏阳性菌链霉素100μg/ml革兰氏阴性菌B3μg/ml局部革兰氏阳性菌、霉菌完全培育基配方〔50mL，10%血清：无血清培育基 45mL血清 5mL青霉素G+链霉素 0.5ml两性霉素B 0.5ml配制前先取出-20℃56℃30min〔热灭〕化冻后再开紫外灯灭菌，做操作前的预备工作。血清和培育基应避开紫外线的过多照耀，以免辐射造成成分的转变。配制时取一较大容积的无菌烧杯，先倒入约一半体积的无血清培育基，参加足量4℃保存备用。培育基的选择不同的细胞系有各自最适合的培育基，选择培育基可通过阅历和试验来确定。本试验室常用的特定细胞的培育基细胞系 培育基Hela RPMI1640DMEMHepG2 DMEMJC RPMI1640NIH3T3 DMEMCHO RPMI1640对于不生疏的细胞系，可以用不同的培育基同时进展培育，看哪种最适于细胞的生长。最终固定下来。三．培育操作根本要求1．：防止污染是打算培育是否成功的首要条件，由于体外培育细胞缺乏抗感染力量，故在安全牢靠。培育前预备：操作开头前应清点所需的全部用品，并放置于操作场地，然后进展消毒，一方面可以的时机。操作前翻开紫外灯对操作野进展消毒。用3030分钟以上，但时间置，否则物品相互遮挡射线，会降低消毒效果。利用超净工作台操作时，由于整个前臂要伸入台内，可先清洗手部和肘部，再以75%酒精棉球擦拭消毒，然后进展操作。假设在无菌室内进展操作，要穿消毒的衣帽，戴口罩和手套进展。在无菌环境进展培育或做其他无菌操作时，首先要点燃酒精灯，以后一切操作，如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进展。留意：烧灼不行过头，以免消灭碳化、变形等现象，玻璃用品可烧灼2-3分钟，塑料用96%的不含杂质的酒精。培育操作：进展培育操作时，动作要准确快速，但又不必太快，以防空气流淌增加污染时机。尽量不要用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，或取性，一般先将D-Hanks、Versen等倒入小烧杯中，再取细胞培育瓶以烧杯中的液体进展操作，用过后马上盖上。吸取不同的液体要使用不同的吸管，不能混用，以防扩大污染或面发生污染。操作后整理操作完毕后应清理超净台，将台面上剩余的液体擦干，废弃物取出，培育基、胰酶等放回1/3净台、培育间开紫外灯灭菌半小时以削减污染。四．复苏细胞的冻存和复苏要遵循慢冻快融的原则，即冷冻的速度慢而溶解的速度快，以避开冰晶的形成损坏细胞。预备较干净的热水浴〔自来水或蒸馏水，水温37℃-42℃。复苏哺乳动物细胞选择42℃37400ml3/4插入温度计，以便随时观看水温。在电炉上将水烧至适宜的温度〔可略高一、两度，以防降温，再移至液氮罐旁。确定所需复苏的细胞在冻存盒中的位置，快速取出投入热水浴中，反复摇动细胞冻存管使〔戴手套操作以防冻伤〕翻开液氮罐取出装有冻存盒的支架的动作要慢，支架向液氮罐内倾斜，使挂在支架上的液氮流回液氮罐，削减铺张。但应尽量削减冻存盒在空气中暴露的时间，以削减温度的变化。取出热水浴中的冻存管，以酒精棉球消毒外部。在无菌环境下吸出冻存管中的液体移入预备4mL50mL12小时后大局部细胞都已贴壁，倾倒去旧的培育基〔含有DMSO，会影响细胞生长5mL五．换液细胞在生长的过程中会消耗培育基中的养分成分并把代谢产物释放到培育基中去。呼吸放出的二氧化碳将使培育基变黄，假设细胞数量尚未到达传代的程度〔铺满70%以上的培育瓶底可传代，这时必需进展换液。倒出旧的培育基，换上等量培育基即可。以免溅起其它废液造成污染。六．细胞传代细胞生长至贴满90%〔一般三到四天乃至死亡〔细胞变圆、收缩，细胞内颗粒明显，细胞贴壁不牢，培育基颜色变黄等。为保证细胞的状态良好，可以在细胞生长到对数生长中期，即70%满瓶时就进展传代。(1)观看：当观看到细胞生长到对数生长中期，70-80%满瓶，同时细胞状态良好时即可传代。留意在进入细胞间观看前，至少要开半小时的紫外，但时间也不行过长，以免臭氧通过换气进入培育箱影响细胞生长。进入前，须先清洗干净手部和肘部，再以75%酒精棉球擦拭消毒后(不得偷懒)再进展观看。*CO2

培育箱时，要动作快速准确，以免CO2

泄漏过多。取出培育瓶时，不要遗忘要快速拧紧培育瓶盖。*在显微镜下观看时，为了要观看贴壁细胞，必需将培育瓶倒置，在倒置时要留意动作不要过大，留神尽量不要让培育基流到瓶口部位。*CO2

培育箱时，不要遗忘将瓶口拧松后再放回。预备：在观看完细胞后，假设打算要做传代，则要将传代所需要的培育基、胰酶等从冰箱取出放于培育间内待用，并需留意在超净工作台内是否有足量的D-Hanks、Versen液，如不够也必需从冰箱中取出储藏液预备补加，取出后也先置于培育间内待用。细胞间及超净工作台紫外照耀至少半小时。传代:在进入细胞培育间进展操作前，请务必按前面所写的要求进展消毒处理。同时为了您的安康也请别遗忘，在进入细胞间内操作时要关了紫外灯再进去。*留意在消毒了双手和肘部进入细胞操作间之后，请勿再接触其它未消毒的物品。*在关闭超净工作台的紫外，翻开有机玻璃挡板后，请先点燃酒精灯再做其它操作。从筒中用止血钳取出一枝灭菌过的玻璃吹管，先将吸头部位在火上烧灼，再套上橡皮胶头，之后再将玻璃吹管的其它局部在火上过几遍，尤其是手曾接触过的局部。消毒后先放置一旁待用。200uL200uL的枪头，置于一旁待用〔用于一会吸取胰酶。CO2

培育箱，在超净工作台内将旧培育基倒入废液缸，先倒入适量〔约4ml〕D-Hank`s液洗一下，再倒去D-Hank`s液，参加适量〔约1.5ml〕Versen液，假设需用胰酶消化，则可再用枪参加200uL胰酶，轻轻混匀后，平置消化。最好记时，一般五分钟左右即适宜。当细胞形态收缩趋圆，细胞间隙扩大，细胞相互分别时即可终止消化。将消化液留神倒入废液缸，再参加适量的培育基，用吹管留神将细胞从壁上吹下，并吹匀后再进展分装一般可一瓶细胞可传为二或三瓶)，分装好的各瓶要补足培育基，再取灭菌后的盖子盖严，放回CO2

培育箱，固然在放入前要将盖子拧松。对于半贴壁细胞，如H9101，不必使用消化液，D-Hanks冲洗一遍后，直接参加培育基，以吹管将细胞从壁上吹下，吹匀、分装即可。昆虫细胞 SF9也是半贴壁细胞，传代时只需倾去旧的培育基，参加的培育基，以吹管将细胞从壁上吹下，吹匀、分装即可。收尾:4℃，同时将超净工作台和细胞间内整理干净，假设废液缸已满，请将其取出洗净，灭菌后再放回细胞间内。当操作完从细胞间出来后，最好翻开紫外再消毒一段时间(<0.5hr)。最终别遗忘关紫外灯。七．细胞保种要长期保存某一细胞系，维持其良好的性状，在进展了15-20次传代后应准时进展保种，将细胞冻存于液氮中。保种用液可以是完全培育基，也可以是全血清。目前本试验室一般承受完全培育基保种，SF9用全血清保种较好。为避开冰晶形成损伤细胞，应参加占总体积10%的DMSO。〔DMSO有弱毒性，尽量不要接触到皮肤〕(1)2-3天的细胞，察，细胞贴壁结实、均匀，折光度小，较透亮，细胞器不明显，死细胞及其它杂质少。(2)消化：将用于保种的细胞取出CO2培育箱，在超净工作台内将旧培育基倒入废液缸，先倒D-Hank`s液洗一下，再倒去D-Hank`s液，参加适量的Versen液，假设需用胰酶消化，则可再用枪参加200uL胰酶，轻轻混匀后，平置消化。最好记时，一般五分钟左右即适宜。当细胞形态收缩趋圆，细胞间隙扩大，细胞相互分别时即可终止消化。将消化液留神〔2ml后，放置一边。分装：目前使用的细胞冻存管有1ml、2ml两种规格，已经过辐照灭菌，密封包装，存放于培育间内。用时将止血钳过火灭菌，从外包装袋中取出所需数量的冻存管，用手捏住冻存管的下部，以止血钳翻开管盖，盖里朝上置于台面上，并将冻存管直立于台面上，酒精灯四周。将已经消化下的细胞再次吹吸混匀，吸满一吹管后逐滴滴入敞口的冻存管内，同时记数。以一滴液体50μl记，1.5ml的冻存管内应滴入18滴细胞悬液，2ml冻存管内应滴入36滴细胞悬液。取200μl加样器，吸取DMSO再次参加冻存管内，1.5ml的冻存管内应参加100μlDMSO，2ml冻存管内应参加200μlDMSO；也可用吹管吸取DMSO，逐滴滴入冻存管内，1.5ml的冻存管内滴入2滴DMSO，2ml4滴DMSO，使DMSO的终浓度到达10%。1~2次，使液体混〔〕冻存将处理好的冻存管置于-20存盒中置于液氮液相中长期冻存。存放液氮气相时可以用纱布制作一小布袋，内放冻存管，袋口栓上细绳，垂放入液氮罐中，当袋底部接触液氮液相时，会发出较大的液体飞溅的声音，这时将布袋略提高一点就是适宜的存放位置。将冻存管转移到冻存盒中的动作要快，以免操作中温度上升。但翻开液氮罐取出装有冻存盒的支架的动作要慢，支架向液氮罐内倾斜，使挂在支架上的液氮流回液氮罐，削减铺张。可以两人协作操作，先翻开冻存盒，再快速取出布袋内的冻存管放入盒内。记清所存放的细胞的准确位置，冻存后记录清楚〔细胞种类、存放液体、冻存时间，保存人〕以备日后查寻。戴手套操作以防冻伤。八．哺乳动物细胞转染细胞在培育基中生长至铺满70％细胞培育瓶底。D-Hanks洗一次，再用Versen5min。Versen3mL完全培育基终止反响，用吹管吹打细胞使之悬浮，吸15µl〔细胞数/mL原液＝计数板上4角大格细胞总数/4×10000×稀释倍数〕依据细胞浓度吸取10－20万细胞至六孔板〔φ＝35mm〕中，每孔加完全培育基补2mL。37℃，5％CO培育箱培育24hr。2混匀脂质体和待转染的质粒〔每孔细胞按以下量加样〕solutionA:吸取大提质粒2µg〔加TE补至总体积400µl40µl41000µl无水乙醇，混匀，液氮中放3min，12023rpm离心10min将上清倾干，沉淀在超净工作台内吹干，以100µl无血清培育基溶解。solutionB: lipofectAMINE2－25µl，加无血清培育基补至100µl。solutionA，B，在室温下放置15－45min。吸去六孔板中的培育基，以2mL无血清培育基洗涤细胞一次。往solutionA，B混合液中参加800µl无血清培育基，混匀，加于六孔板的裸细胞上，37℃CO培育箱25hr。往各孔中参加含正常量2倍血清的培育基〔不加抗生素〕。在开头转染后18－24hr，吸去六孔板中的混合液，参加2mL完全培育基培育。转染48小时后观看并检测培育上清。SF9转染细胞在培育基中生长至铺满70％细胞培育瓶底。倾去旧培育基，参加约3mL完全培育基，用吹管吹打细胞使之悬浮，吸15µl至细〔细胞数/mL原液＝计数板上4/4×10000×稀释倍数〕依据细胞浓度吸取10－20万细胞至六孔板〔φ＝35mm〕中，每孔加完全培育基补2mL。27℃恒温箱中培育2~6小时。混匀脂质体和待转染的质粒〔每孔细胞按以下量加样〕solutionA: 吸取bacmid2µg加无血清培育基补充到100µl。solutionB: 吸取Cellfectine2－25µl，加无血清培育基补至100µl。solutionA，B，在室温下放置15－45min〔一般选择30min〕吸去六孔板中的培育基，以2mL无血清培育基洗涤细胞一次。往solutionA，B混合液中参加800µl无血清培育基，混匀，加于六孔板的裸细胞上，27℃恒温箱中孵5小时。吸去六孔板中的混合液，参加2mL完全培育基培育。⑺转染18小时后观看并检测培育上清。〔8〕转染72细胞碎片等杂质，可以2023转离心2分钟，无菌状态下吸取上清，4℃避光保存。附1：Bacmid将转移质粒转化TSS致敏缓冲液制备的E.coliDH10Bac感受态细胞，该细胞含有穿梭质粒Bacmid和关心质粒，关心质粒可以帮助转移质粒pFB载体上转座子内侧的外源基因转移到Bacmid8μl质粒参加到100μl30min，再往转化管中参加900μlLB〔留意不要做热休克〕，37℃100rpm/min摇培4h后转移质粒在Bacmid的LacZ编码区，并使DH10Bac获得庆大霉素抗性。将摇培后的菌液倍比稀释〔1：10〕，各取200μl均匀涂布在含有X-galIPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的LB平板上，37℃倒置培育24hr以上，观看菌落的密度和白色菌落的数量，选择一个平板上均匀长有200多个菌落的，以无菌牙签挑取白色的单菌落，挑入含三种同样抗性的液体LB培育基中，37℃震荡培育过夜，碱法小量提取重组病毒DNA〔bacmid〕。收集3ml菌液中的菌体，按碱法小量提取质粒的步骤参加溶液一、二、三，但将用量分别提高到200μl、400μl和300μl。冰水浴5min后12023rpm离心10min，吸取上清，用等体积氯仿抽提二次，留意参加氯仿后不行用力震荡，盖紧管盖后反复轻柔颠倒，直至水相和有机相〔有时还会消灭白色的蛋白抽提物eppendorf4℃放置10min，12023rpm离心10min，沉淀即bacmid。70%乙醇洗涤沉淀一次，用移液器尽量吸干管内附着的液体，放开eppendorf管，在超净台内吹干〔约需半小时〕，参加40μl无菌TE或水，65℃放置10min使之溶解完全，可用于转染。留意，提取的bacmid4℃-20℃保存的bacmid在冻融后简洁断裂，影响转染效率，因此不宜在-20℃保存。附2：DH10Bac选择培育基抗生素含量50μg/ml kanamycin〔卡那霉素〕7μg/ml Gentamicin〔庆大霉素〕10μg/ml Tetracycline〔四环素〕100μg/mlX-gal&40μg/ml为了节约X-gal和IPTG的用量，在铺固体培育基平板时不参加这两种物质，而是在涂布平板前半小时，以200μlLB培育基稀释40μlX-gal〔母液浓度100μg/ml〕和6.7μlIPTG〔母液浓度500μg/ml〕，37℃恒温箱，待溶液被吸取后，再涂布转化的菌液。细胞计数用血球计数板做细胞计数〔见图〕。依据状况用养分液稀释与否均可，如先稀释，计算时20μl细胞悬液，从计数板边缘轻轻滴入，使悬液自由布满盖玻片下方间隙，勿留气泡。盖玻片与血球计数板之间大约可容纳10μl的液体，多余的会自动流出盖玻片外。稍候片刻，显微镜下观看并计算出四角大格内的细胞数〔图中蓝色的局部〕；压线者只计上线和右线的细胞，然后按下式计算出细胞浓度：〔四大格中细胞总数/4〕×10000×稀释倍数=细胞数/毫升原液留意：1〕细胞悬浮后应用吹管轻轻反复吹打片刻，以使细胞充分散开，如计算时仍见有团块，应按单个细胞计算,如细胞团数占10%以上，说明消化不充分，或细胞数少于200个/10平方毫米或多于500个/10平方毫米时，均说明稀释不当，需重制备细胞悬液，再重计数；2〕取样前仍需用吹管稍吹打，以防细胞沉降，另外向计数板滴入悬液量不能过多，致使盖玻片漂移；或过少易有气泡。←1.0mm|←1.0mm→←1.0mm→||←1.0mm→|1.0mm→←1.0mm|→深0.1mm |血球计数板十．软琼脂试验〔soft-agarcolony〕细胞和恶性细胞却无大影响。琼脂的这种选择性作用，一是很多细胞难以贴附，二是其中含有抑制的多聚阴离子，不利正常的细胞生长。琼脂经降低毒性处理，特别是削减多聚阴离子后的产物即为琼脂糖〔Agarose〕。琼脂糖可用作克隆不能在琼脂中生长〔因毒性〕的贴附依靠性细胞。试验证明，恶变细胞或恶性转化细胞在软琼脂〔1.2%〕中的生长与在裸鼠体上的致瘤性有很大的全都性。因此测试细胞能否在软琼脂中生长，已成为测试转化细胞恶性性的重要指标，用以测定转化后的克隆形成率。具体做法如下：试剂及材料的预备：5×培育基：取一包培育基干粉〔1000ml用量〕以200ml双蒸水溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃储存备用。琼脂糖溶液：在两个100ml盐水瓶中以双蒸水分别配置两种浓度的琼脂糖溶液，铝铂封口，再分别放入两个盛有一半水的大烧杯中，报纸封口，扎紧后高压灭菌，随后马上放入45℃水浴中，保持其液体状态。a.0.72%agar0.25gagar+34.5mlddH2Ob.0.5%agar0.15gagar+29.5mlddH2O5mleppendorf管，1ml、200μl枪头。操作步骤：在5mleppondorf管中混匀1ml 5×培育基〔37℃预热〕500μl 血清3.5ml0.72%agar〔45℃预热〕50μl 100×抗生素马上参加35mm平皿中，每皿1ml，凝固后成为下层基质。在5mleppondorf管中混匀1ml 5×培育基〔37℃预热〕500μl 血清3ml0.5% agar〔45℃预热〕临时置于37℃。将待检测的细胞消化下来，计数，调整浓度到略大于100万个/毫升，取500μl与B液混匀，以每皿1ml的量参加到已铺有A琼脂层的平皿中，室温下待其凝固。平皿放置于二氧化碳培育箱内培育2Gimsa染色，拍照。大于10个细胞的集落算做一个克隆，依据克隆的数量确定细胞恶性转化的效率。十一．细胞单克隆的分别哺乳动物细胞单克隆株分别：72hrVerson50mL玻璃培育瓶中培育，待细胞生长至根本贴壁时再参加含作用浓度为400ug/mLG4182～3G4182～3将已形成细胞克隆的培育瓶置于显微镜下，观看克隆的位置，并用记号笔将其标出。(3)Verson5～20s后取出在加有完全培育基(600uL/孔)的24孔板中刷洗数次，将附着上的细胞洗下。245%CO37℃进展培育。22480ELISA测。将经检测可表达目的基因的细胞克隆转入50mL螺口培育瓶中连续培育，并在适当的时候进展传代换液，扩增细胞，进展进一步的鉴定。淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术一、细胞融合前预备(一)免疫方案选择适宜的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb前两个月左右确立免疫方案开头初次免疫，免疫方案应依据抗原的特性不同而定。颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫 1×10７／0.5mlip(腹腔内注射)↓2～3其次次免疫 1×10７／0.5mlip↓3加强免疫(融合前三天)1×10７／0.5mlip或iv(↓取脾融合可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上集中呈小滴状说明已到达油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。初次免疫 Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射│ 0.8～1ml0.2ml／点)↓3其次次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│ (ip0.5ml)↓3第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│(5～7↓2～3加强免疫，剂量50～500μg，ip或iv取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增加了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②转变抗原注入的途径，根底免疫可直接承受脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反响性。(二)饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，很多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培育过程中，参加饲养细胞是格外必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠承受与免疫小鼠一样的品系，常用BaLb／c14-16↓拉颈处死浸泡于753～5↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜↓用无菌注射器注入6～8ml↓反复冲洗，吸出冲洗液↓10ml，12005～6↓20％小牛血清(NCS)(FCS)1×10５／ml↓96，100μl／孔↓37℃CO2

孵箱培育一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞.(三)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb。SP20、NS1X63Ag8.653等。骨髓瘤细胞的培育适合于一般的培育液，如DMEM培育基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml1∶103～5倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或稍微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在预备融合前的两周就应开头复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是打算细胞融合的关键。(四)免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培育液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。(一)细胞融合流程取对数生长的骨髓瘤细胞SP20，1000rpm5细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培育液洗涤2同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培育液洗涤2将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶101∶550ml1，1200rpm,8分钟。弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。在室温下融合:①301ml45％PEG(SIGMA,1500),90120PEG1ml2ml3ml4ml，5ml10ml离心，800rpm，66ml20DMEM在一起的细胞散开。9610ml96将融合后细胞悬液参加含有饲养细胞的96100μl／孔，37℃、5％CO孵箱培育。2961×107脾细胞。(二)HAT24HAT选择培育液。HT和HAT50×贮存，用时1ml50ml20200μl／孔。所以在加选择培育液时应加3倍量的HAT2／350×HATH:5×10-3MA:2×10-5MT:8×10-4MHATHT液。筛选杂交瘤细胞通过选择性培育而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10瘤细胞系。检测抗体的方法应依据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有:ELISAMcAbRIAMcAbFACS(McAbIFAMcAb牢靠的筛选方法必需在融合前建立，避开由于方法不当贻误整个筛选时机。克隆化一般是指将抗体阳性孔进展克隆化。犚rHAT个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进展克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，由于抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丧失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丧失，从而丧失产生抗体的力量。(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液(同融合前预备)②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml③取1306.5ml20ml，100μl／孔加AB、C22.9ml2.9ml含饲养细胞的完全培育液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F12.2ml2.2ml细胞的完全培育液，细胞数5／ml，100μl／孔，加G、H0.54～5200μl／孔。8～9注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培育液中加HT。软琼脂法①软琼脂的配制20％FCS(2DMEM1％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。0.5111202DMEM42℃保温。②用上述0.5)15ml9cm后作为基底层备用。100／ml，500／ml5000／ml④1ml0.5(42℃1ml⑤混匀后马上倾注于琼脂基底层上，在室温中1037℃，5％CO2孵箱中。⑥4～57～1024培育。⑦检测抗体，扩大培育，必要时再克隆化。(二)杂交瘤细胞的冻存准时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是格外重要的。由于在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培育过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体力量的丧失等等。假设没有原始细胞的冻存，则由于上述的意外而全功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以24一孔就可以冻一支安瓿。细胞冻存液:50％小