第五章 分子生物学研究方法

第五章分子生物学研究法(上)

5.1重组DNA技术回顾

5.1.1主要三大成就

1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；

2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半

保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；

3.50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。

5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基

1、DNA分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应

5.1.3主要事件重组DNA技术历史上的主要事件

年份事

件

1869FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944O.T.Avery证实DNA是遗传物质。1952A.D.Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1958M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留复制模型。1959-1960S.Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。

1964

C.Yanofsky和S.Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965

S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。1966

M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。1978

首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。

1982美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983

获得第一例转基因植物。1984

斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1986

GMO首次在环境中释放。1988

J.D.Watson出任"人类基因组计划"首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠--"Oncomouse"。1992

欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。2001完成第一个人类基因组全序列测定。重组DNA技术(recombinantDNAtechnique):是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。基因克隆(genecloning)分子克隆(molecularcloning)5.1.4重组DNA技术的概念基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA。分子克隆在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。5.1.5重组DNA技术的基本步骤1、四大要素

①外源基因②载体③工具酶④受体细胞

2、重组DNA技术的基本步骤

①目的基因的获得与载体的制备②目的基因与载体DNA的连接③重组DNA分子导入受体细胞④重组体的筛选与重组DNA的鉴定⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交5.1.6重组DNA技术的意义重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端末端转移酶在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶Ⅲ从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团5.1.7重组DNA实验中常见的主要工具酶限制性核酸内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)即反相重复结构，是

DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口DNA连接酶:通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片断连接成一个整体DNA分子。T4¯DNA连接酶EcoRI连接酶T7¯DNA连接酶目的基因的来源原核细胞真核细胞：cDNA或gDNA文库人工合成及PCR扩增目的基因

天然DNA（染色体DNA、病毒DNA(噬菌体DNA)、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA）5.1.8重组实验中的主要载体定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。5.1重组DNA技术回顾克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。5.1重组DNA技术回顾载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA；克隆载体必须是安全的。5.1重组DNA技术回顾噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb，两端有一个12个核苷酸5′端突出粘性末端λ噬菌体：置换型、插入型黏粒、YAC、BAC：高容量载体质粒载体：PBR322载体、PUC质粒载体5.1重组DNA技术回顾克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小质粒：10kbλ噬菌体：23kb黏粒(含有cos位点的人工构建克隆载体。cos位点是λ噬菌体头部组装时的识别序列，因而黏粒能包装入λ噬菌体颗粒后感染大肠杆菌。)：45kb细菌人工染色体BAC：350kb酵母人工染色体YAC：1000kb5.1重组DNA技术回顾一个完整的基因克隆过程包括以下步骤

１.获得待克隆的DNA片段（基因）；

２.目的基因与载体在体外连接；

３.重组DNA分子导入宿主细胞；

４.筛选、鉴定阳性重组子；５.重组子的扩增与／或表达。

以质粒为载体的DNA

克隆过程常规质粒载体质粒(plasmid)

Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。

Plasmidchromosome

基因载体应具备的条件：（1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；（2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；（3）有一定容量；（4）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。

基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。4、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。质粒的生物学特性5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。

第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如PUC系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。

发展概况

pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。

许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。

pBR322p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。普通型载体pBR322的结构图质粒载体pBR322的大小为4361bp，相对分子量较小带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp（氨苄霉素）平板Tet（四环素类抗性基因）平板pUC质粒系列pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。

它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ部分基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。

476bp片段含有E.coli的lacZ基因的5’-序列，表达半乳糖苷酶的α片段。

LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。

lacZ之内是M13的多功能连接器。三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用-互补原理进行蓝白筛选。（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。

其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。λ噬菌体载体

噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。

侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖。图左示λ噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。

λ噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogen）。λ噬菌体的生活周期：裂解λ侵入细菌-独立复制-裂解（冲破细胞膜）-再感染其他细菌。λ噬菌体的结构和用途λ噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的12nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48531bp，含50多个基因。λ噬菌体基因大致分为4个区：

结构区A～J19个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区,重组区

att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和N、CI基因，O-R为裂解区.

λ噬菌体及其组件的应用

λ噬菌体可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达20kb的λDNA，换入相应长度的目的基因。

基因文库构建常使用λ载体；不少先进的质粒应用λ组件进行构建。λ噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导:

分离得到某些λ噬菌体，在低温时（30℃）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。这些λ噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为cIts。

λclts1857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在λclts857下游，重组体的目的基因在42℃表达，30℃不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。λCIts857ori目的基因PL阻遏蛋白30℃下培养：目的基因阻遏蛋白42℃下培养：失活（1）粘粒（cosmid）能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb～6kb）载体。组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连接入的λcos位点。构建基因文库的λ载体（2）λDNA的体外包装是提高λ噬菌体转染效率的有效方法在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部。高效表达质粒pBV系列质粒

pBV221分子量小，易转化，含有串联的来自λ噬菌体的强启动PL及PR，启动子的串联可能有相互增强作用。含有λCIts857组件，此组件可变温诱导目的基因的表达。这一组件的存在，还可适当地抑制宿主菌的蛋白酶活性，达到提高表达量的目的。带有真核生物基因表达组件的质粒

真核生物与原核生物催化转录、翻译及其后修饰的酶和起始复合物的结构不同，医学研究需要能表达真核生物基因的表达载体。由于病毒对宿主细胞有依赖性和可整合性，真核表达组件不少来自病毒。如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。酵母质粒和大容量载体酵母是单细胞真核生物，可接受质粒转化。酵母质粒有Yip（integrate）整合型，

Yep（epi-some）附加体型，

Yrp（replication）复制型。

pYEJ001

一种以pBR322为基础的酵母质粒，两个抗药基因及左下方的半圆来自pBR322，右上半圆来自酵母，包括启动子、糖代谢酶类及氯霉素抗性基因，可在大肠杆菌体系重组再转化酵母细胞称为穿梭质粒（shuttleplasmid）昆虫杆状病毒（baculovirus）如核型多角体病毒ACNPV，昆虫体系的优点是表达效率高，目的基因插入的容量相对大，使用安全等。目前在农业基因工程上应用较多。如携带杀虫基因的病毒对农作物进行生物防治。YAC酵母人工染色体把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。

pYAC只以单抄本方式繁殖，所以不适用于以生产为目的的基因工程。主要用于人类基因组研究和巨大基因如DMD基因达Mbp（106bp）数量级基因的克隆。

基因工程的表达体系原核生物表达体系：

大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌大肠杆菌表达体系的优点：积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；操作安全，致病能力低；成本相对低得多；真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆（subclone），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。缺点：原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；没有加工所需的酶系统；热源、内毒素不易除去；（热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质；内毒素的化学成分是脂多糖，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组分之一）常会形成包涵体。（蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物）。

表达体系的发展

表达体载体宿主第一代原核生物表达体系质粒、噬菌体细菌第二代酵母表达体系穿梭质粒酵母第三代哺乳类细胞表达体系病毒、脂质体培养细胞第四代基因直接导入DNA本身生殖细胞、体细胞、个体

基因工程的目的是使目的基因能高效表达。基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结合等组成的表达体系的调控。

基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰等水平进行基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。核酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯下确定DNA在凝胶中的位置。5.2.1核酸凝胶电泳技术影响核酸电泳的因素：

在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定:

1、DNA的分子大小:

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比。

2、琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。3、DNA分子的构象

当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。4、电源电压

在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。5、嵌入染料的存在

荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15％。

6、离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。核酸电泳常用的指示剂有两种：⑴溴酚蓝⑵二甲苯青，

DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖主要从海洋植物中提取来的，为一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽相同。对DNA电泳迁移率的影响也不一样，经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显变化，主要用于DNA的限制酶原位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10～500bP）的分离。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。DNA的琼脂糖凝胶电泳DNA的聚丙烯酰胺电泳DNA的聚丙烯酰胺电泳

普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳。5.2DNA基本操作技术5.2.2细菌转化转化（transformation）

：感受态细胞（Competentcells）

：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法、点击法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许有外源DNA的载体分子通过。所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。常用的转化方法：化学转化（CaCl2）法电击法

化学转化原理：

在0℃冷冻处理时，处于CaCl2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的热冲击下，细胞吸收外源DNA，然后在丰富培养基内复原并增殖，表达外源基因。5.2常见的DNA操作技术P1655.2常见的DNA操作技术电击转化：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。菌液：生长对数期场强(最大转化效率)：12.5-15kV/cm

温度：0-4℃

5.2常见的DNA操作技术克隆的筛选：抗生素基因。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等-互补蓝白斑筛选营养条件（自养、异养）5.2常见的DNA操作技术-互补筛选5.2常见的DNA操作技术β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞IPTG/X-gal的培养基上筛选蓝白斑（异丙基-D硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）

乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖乳糖类似物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。

IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。LacZ基因编码的半乳糖苷酶

X-gal

蓝色吲哚产物蓝白斑试验（IPTG-Xgal试验）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷诱导物

ZYX

PO

ZYX

PO乳糖标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZX-galLacZ蓝色化合物X-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

5.2.2聚合酶链式反应（PCR）技术1985年，K.Mullis等研究成功的一种在体外快速扩增特定基因DNA序列的方法

原理：类似于天然的DNA复制过程。将待扩增的DNA片段和两侧互补的两段寡核苷酸引物，经过变性，退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n

倍5.2常见的DNA操作技术反应体系模板DNA：待扩增的目的片段特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序列互补的寡核苷酸片段，15-30bpDNA聚合酶dNTP含有Mg2+的缓冲液5.2常见的DNA操作技术

PCR的基本反应步骤：

1.变性：95℃，模板DNA变性为单链；

2.退火：50℃左右，使引物与模板DNA退火结合；

3.延伸：72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经25-30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。5.2常见的DNA操作技术

多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。PCR技术在基因克隆方面的应用

（1）目的基因的直接克隆，（2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆；（3）制备DNA探针，进行分子检测等。5.2常见的DNA操作技术5.2.4实时荧光定量PCR通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行。PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

与普通PCR的区别

普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。

荧光定量PCR化学原理

非特异性荧光标记：

1、SYBRGreen

特异性荧光标记：

2、TaqManSYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲线分析

SYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便--不必设计复杂探针非常灵敏便宜2、TaqMan探针法

TaqMan作用机理

TaqMan法优缺点

5.2.5基因组DNA文库构建

基因组DNA文库 存在于转化细菌内， 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合。 简称G－文库。5.3RNA基本操作技术1.总RNA的提取：RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。异硫氰酸胍法（TriZol）原理：TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。2.mRNA的纯化mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。利用mRNA的PolyA结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚dT引物，与PolyA杂交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂交体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以链抗生物素-顺磁颗粒（SA-PMPs）结合杂交体，形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs复合物，再利用磁性吸附作用以磁性条吸附复合物中的SA-PMPs颗粒，最后利用高严紧度盐溶液中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚dT引物与mRNA分离，从而纯化得到mRNA。PolyATtractmRNA的分离纯化过程简图cDNA的合成cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，有反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligodT。第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。5.3.4cDNA文库定义：cDNA文库(complementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。原理：将带poly(A)的mRNA经酶促反应转变为双链DNA，再与原核载体连接。cDNA文库的构建

真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都只有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。构建步骤：1、高质量mRNA制备：纯化试剂盒，生物素2、反转录生成cDNA:反转录酶，olig(dt),R63、与噬菌体载体分子连接4、噬菌体的包装cDNA第一链的合成

oligo(dT)引导的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。缺陷：

因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5’-末端，必须从3’-末端开始合成cDNA。对于大分子量的较长的mRNA分子而言，特别麻烦。随机引物引导的cDNA合成法

(randomlyprimedcDNAsynthesis)：根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。cDNA第二链的合成1、自身引导合成法：单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶IKlenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。缺点：

在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA5’端的地方的序列出现缺失和重排。S1核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链cDNA分子。第二链cDNA的合成氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA链

第一链cDNA的3'-末端就会形成一个发夹环

合成第二链cDNA

S1核酸酶消化连接处

自身引导法合成cDNA第二链2、置换合成法原理：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。优点：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化

c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA双链cDNA的分级分离连接前回收大于500bp的cDNA用于连接。去掉引物、接头及反转录产生的各种不完整的cDNA链，提高文库质量。5、双链cDNA与载体连接1）同聚物加尾：2）加接头引入酶切位点，添加带有限制性酶切位点的接头是最常用的方法3）cDNA的定向插入：cDNA两端添加不同的限制性酶切位点，双酶切后与对应的双酶切载体连接末端转移酶+dCTP末端转移酶+dGTP载体和cDNA退火同聚物加尾法：CH3CH3CH3CH3CH3CH3接头加接头cDNA的定向插入

五、cDNA文库的筛选和鉴定基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多种，常用的有：核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法1、表型筛选：在宿主菌中表达目的基因，使宿主产生新的表型或使宿主恢复其突变基因的表型来筛选目的基因。(1)抗药性筛选:这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。(2)插入失活筛选法(3)显色反应选择法(α-互补法)

将含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为α-互补。2、菌落原位杂交法探针：1）同源DNA探针邻近种属的相应基因2）根据氨基酸序列设计简并探针引物：1）同源引物邻近种属的相应基因2）根据氨基酸序列设计简并引物3、PCR筛选法4、免疫筛选需制备目的基因产物的抗体进行筛选。基因组DNA文库与cDNA文库的比较5.4SNP的理论与应用SNP（singlenucleotidepolymorphism）单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，源于单个碱基的转换或颠换应用：遗传病研究、动植物遗传育种5.4.2SNP的检测技术1、基因芯片技术2、分子信标技术3、焦磷酸测序法5.5基因克隆技术1、定义2、步骤：（1）目的基因的获得（2）形成重组体（3）导入寄主细胞（4）选择和筛选5.5.1RACE技术RACE技术（rapidamplificationofcDNAends）是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用于扩增3’端的称为3’RACE。。已知序列cDNA的来源序列表达标签减法cDNA库差式显示基因文库筛选5.5基因克隆技术获得高质量总RNA去磷酸化去掉mRNA5′帽子结构加特异性RNA寡聚接头合成第一条cDNA链5′RACE3′RACE将纯化后的PCR产物克隆到载体DNA中，进行序列分析RACE主要操作方法5.5.2应用cDNA差示分析法克隆基因cDNA差示分析法(Representationalditterenceanalysis)RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增目的基因片段。试验对象（Tester）供试探针（Driver）4碱基切割酶处理平均长度256bp的代表群cDNAcDNA加12/24碱基接头补平末端以24碱基的互补序列为引物进行PCRT改换新接头D不加接头杂交：T:D=1:100设计新接头引物PCR指数扩增产物差异产物5.5.3基因的大规模克隆技术产生背景：随着越来越多的动植物基因组全序列被测定，许多新的基因被识别，但是，这些基因的功能还是个未知数。要明确这些基因的功能，就必须将其连入到各种载体，进行蛋白质表达、表型分析、细胞内定位等一系列的研究。传统的酶切方法不能很好的满足这种大规模克隆的需要，因此Invitrogen公司(网站)开发了一种高效快速的基因大规模克隆技术——Gateway基因大规模克隆技术。Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。采用Gateway技术，你能够很容易将目的基因转化到其它的表达系统中，包括哺乳动物、昆虫、酵母和大肠杆菌来进行进一步的研究。Gateway克隆技术的优点Gateway克隆技术在λ噬菌体特异位点重组系统的基础上进行一系列修饰、改造，提高了这一重组系统的效率与特异性。Gateway克隆技术主要包括TOPO反应和BP－LR反应。1、TOPO反应TOPO反应将目的基因PCR产物连入Entry载体Entry载体TOPO酶切PCR产物退火连接切去3′GTGG后使PCR产物以正确的方向连入Entry载体2、BP－LR反应BP－LR反应被用于将目的片段从Entry载体中重组入表达载体attR1和attR2位点目的载体接头目的基因接头attL1和attL2位点形成新的位点attB1和attB2目的基因被转移到表达载体中重组蛋白导入宿主5.5.4基因的图位克隆法所有具有某种表现型的基因都可通过该法克隆得到。首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记。在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cM（厘摩）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cM≈1000kb;拟南芥菜中，1cM≈290kb;小麦中，1cM≈3500kb运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA，随机扩增的多态性DNA)。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性.5.6蛋白质组与蛋白质组学技术

蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。5·6蛋白质组学及其研究技术蛋白质组学：可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。5·6·1双向电泳技术双向电泳（twodimensionelectrophoresis，2－D）是分离混合蛋白质最常用的方法。双向电泳由两部分构成：等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）。该方法是依赖于蛋白质的等电点的不同和相对分子质量的不同而构建的。蛋白质组分离技术双向凝胶电泳技术双向凝胶电泳技术(2DE)：又称二维电泳，其原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦(isoelectricfocusing，IEF)和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)，把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。完整的双向凝胶电泳分析，包括样品制备、等电聚焦、平衡转移、SDS—PAGE、斑点染色、图像捕捉和图谱分析等步骤。所用仪器1、等电聚焦电泳pH>pI带负电pH<pI带正电pH=pI不带电溶液蛋白质2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）十二烷基磺酸钠(SDS)和少量巯基乙醇蛋白质中的多肽链处于伸展状态形成SDS-蛋白质复合体具有相同的荷质比具有相同的构象蛋白质电泳速度由质量决定原理十二烷基磺酸钠原态蛋白质磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）双向电泳5.6蛋白质组与蛋白质组学技术双向电泳技术pH3pH10IEFSDS分子生物学中最常用的蛋白质技术可能是蛋白质印迹法（Westernbloting），又称免疫印迹法（immunobloting）。原理：经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。2.蛋白质印迹法免疫印迹法程序可分为五个部分：蛋白样品的制备经过SDS分离的样品分离的蛋白转移到膜载体上，转移后将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附用固定在膜上的蛋白作为抗原，与对应的非标记抗体（一抗）结合洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性标记的二抗，通过显色或放射自显影来检测蛋白。2.用于二级抗体的检测有以下三种：放射性标记的抗体与酶偶联的抗体与生物素相偶联的抗体3.蛋白质质谱分析技术蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定电泳后分离的蛋白质。该技术是一种超灵敏的技术，从理论上说，仅需少量样品就可获得误率低于百万分之一的结果。作业1、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？2、PCR的基本原理？3、基因工程的概念和意义4、基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么？5、基因组学的研究对象和目的是什么？主要有哪些技术和方法？

第六章分子生物学研究法(下)

基因功能研究技术6.1.1基因表达系列分析SAGE是一种以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。两个依据。6.1.2RNA选择性剪切RNA选择性剪接是指用不同的剪切方式（选择不同的剪切位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。选择剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因表达多样性的重要表现形式。6.1基因表达研究技术检测方法RT-PCRcDNA以两端特异序列设计引物观察PCR产物大小是否存在差异存在差异有选择性剪切提取不同组织的总RNA分离mRNAPCR不存在差异无选择性剪切图6-26.1.3原位分子杂交技术

DNA变性:

当溶液中的DNA分子处于高温或高pH值(13)条件下,维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏,DNA双链解离成两条单链,这一过程叫DNA变性。

DNA复性:

当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性，两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构,这过程叫DNA复性,又叫DNA杂交。

核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。

原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行杂交,叫原位杂交。可用于DNA、RNA定位研究。荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。6.1.4定点突变技术定点突变（site－directedmutagenesis）是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、维修表达载体、引入新的酶切位点等。体外定点突变的具体方法有三种：（1）寡聚核苷酸介导的定点突变；（2）双引物法定点突变（重叠延伸技术）；（3）大引物诱变法。以上三种方法虽不同，但原理都一致。1、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术已知序列的环状DNA人工合成一段引物变性模板定点突变细菌转化延伸诱变寡核苷酸引物DNA聚合酶筛选引入突变的环状DNA2、重叠延伸技术正向诱变引物FM反向引物R2正向引物F2反向诱变引物RM已知序列DNA模板在重叠区发生退火PCR3使用引物F2和R2扩增PCR4全长突变DNA片段形成全长双链突变DNA反向互补产物产物21PCR3、大引物诱变法PCR1产物正向诱变引物（M）反向引物（R1）双链大引物退火和野生型基因复性PCR2正向引物（F2）退火温度PCR2>PCR1已知序列DNA模板全长突变DNA片段6.2基因敲除技术概念：基因敲除技术（geneknockout)又称基因打靶（genetargeting）。这种技术是通过基因工程的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲入），然后从整体观察实验结果，从而推测相应基因的功能。这种人为地把实验动物某一种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。基因敲除技术完全基因敲除条件型基因敲除1、完全基因敲除完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。基本原理:构建与靶基因同源(10～15kb)的载体外显子插有新霉素抗性基因（neor）作为正选择的标志疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择体外培养新霉素(G418)和致死核苷类似物(GANC)作双重筛选将重组体导入ES细胞存活的ES细胞图6-10胚胎干细胞(embryonic

stem

cell,ES):是胚胎发育期的胚细胞2、条件型基因敲除

条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。常用的条件型基因敲除有：噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统酵母细胞的FLP/FRT系统、R/RS系统Cre重组酶于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号：X03453），编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个34bp的LoxP位点之间的特异性重组LoxP（locusofX-overP1）位点来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：

ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT动物基因敲除技术电穿孔、显微注射等植物基因敲除技术T-DNA插入失活技术意义：①研究基因功能②转基因动物的制备③用于药物筛选的动物模型④转基因动物可作为“生物反应器”生产药物6.3.1酵母单杂交法酵母单杂交（yeastone－hybridsystem)是一项常用于研究DNA与蛋白之间的相互作用的方法。特点：通过该方法可以识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物DNA与蛋白之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶