分析化学 第十章 色谱法

10.1色谱分析法的原理和分类10.2色谱分离的基本理论10.3气相色谱法10.4高效液相色谱法10.5色谱-质谱联用技术简介第十章色谱法

(Chromatography)10.1.1色谱分析法的基本原理色谱分离在相对运动的两相间进行：一相叫流动相(mobilephase)，是色谱分离的动力源;另一相为固定相(stationaryphase)，是实现分离的主要因素;流动相携带混合物流过固定相时，因各组分在两相间的分配平衡(或吸附平衡等)的差异，使各组分随流动相移动的速度有差异，经多次平行其差异被放大，从而被一一分离开来。10.1色谱分析法的原理和分类若A组分在固定相中的分配系数大于B，则移动速度小于B，将后出峰。

不同的出发点有不同的分类方法：1．按两相状态分类

流动相为气体的称为气相色谱(gaschromatography)

流动相为液体的称为分别液相色谱(liquidchromatography)。

然后，根据固定相是液体(附着于固体表面的一层液态有机物)还是固体又可再分为:

气液色谱、气固色谱、液液色谱、液固色谱。10.1.2色谱分析法的分类2．按分离机理分类利用固定相表面对组分吸附能力的差异而实现分离的：

吸附色谱(adsorptionchromatograph)借助组分在固定相和流动相中溶解能力的差异而实现分离：分配色谱(partitionchromatography)。利用固定相对离子的交换能力不同实现分离的：

离子交换色谱（ion-exchangechromatography）。3．按固定相形状分类将固定相在分离时所处的形态可分为：柱色谱：填充柱、毛细管柱、整体柱等类型平面色谱：纸色谱和薄层色谱10.2色谱分离的基本理论10.2.1色谱流出曲线和色谱参数

1.色谱流出曲线保留值:死时间

tM：不被固定相吸附或溶解的组分从进样到出现该惰性组分色谱峰顶点的时间；保留时间

tR：组分从进样后到出现某组分的色谱峰顶点所需的时间；可作为色谱定性的依据调整保留时间

t’R：扣除死时间后组分的保留时间2、常见色谱参数峰参数

峰高

h：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离

峰宽：有3种表示方法

峰底宽W：通过色谱峰两侧拐点所作的切线与基线交点之间的距离

半峰宽W1/2:峰高一半处色谱峰的宽度

标准偏差σ：0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半

W=4σ=1.7W1/2

峰面积A：

A=1.065×W×h可作为色谱定量的依据色谱是分离的方法，就需关注决定分离的因素：①两组分的保留值之差（组分谱带的分离速度）——热力学因素，取决于各组分与固定相、流动相的相互作用之差异；

②两组分的峰宽（组分谱带的扩张速度）——动力学因素，反映了组分区带在移动过程中的扩张程度，取决于色谱的分离条件。10.2.2色谱分离的基本理论谱带分离速度>谱带扩散速度谱带分离速度<谱带扩散速度组分谱带分离的速度与组分谱带的扩张速度的相对大小决定相邻组分分离的好坏动画页，点击后谱带会移动。1．分配系数和分配比分配系数和分配比是分配色谱决定组分保留值（也即谱带分离速度）的因素。(1)分配系数

K

(partitioncoefficient)

——在一定温度和压力下达到平衡状态时某组分在固定相和流动相中浓度的比值(2)分配比

k(capacityfactor,容量因子)——组分在固定相和流动相中分配量(质量或物质的量)之比：(3)选择性因子(selectivityfactor，，

相对保留值r

)可以看到，只有r≠1时，两组分才有可能被分离。

两组分在给定色谱系统中的K(或k)的差异是色谱分离的前提K是温度的函数，分离也受温度的影响。

结论:改变组分分离状态可以采取的手段

：优化流动相和固定相的组成改变温度来。组分在色谱系统中从进样时的“塞状”到柱后的“峰状”，说明谱带在色谱柱内移动时不可避免地出现了谱带扩张，对相邻组分的分离是不利的。组分峰的宽度是色谱柱分离效率（separationefficiency，

也称为柱效，columnefficiency）好坏的直观表现。色谱理论将探讨定量描述影响柱效的因素。2．谱带扩张和柱效塔板理论是由Martin等人在平衡色谱理论的基础上发展起来的。他们把色谱柱比拟为分馏塔，中间设想成可分为许多分馏塔片（板）。色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：N，(1)塔板理论色谱柱是由一连串高度为H的塔板所组成；流动相按前进方向以脉冲的形式携带分通过柱子中的每一块塔板；在每块塔板上，组分能迅速在两相间达到分配平衡；组分在柱内两相间的分配系数是恒定的，与组分浓度及在柱内的位置无关。根据塔板高度的定义，可以得到：①塔板理论的描述组分在两相间的达到平衡次数（理论塔板数N）越多，色谱柱的分离效率就越高。所以理论塔板数是衡量色谱分离效率（即柱效）的量度。当组份在色谱两相间的分配平衡次数（理论塔板数N）大于50后，色谱峰基本对称；当N>1000后，色谱流出曲线呈正态分布；如果不同组份在色谱两相间的分配平衡系数有微小差别，经过反复多次的分配平衡后，可以得到良好的分离。理论塔板数可以用色谱峰参数计算得到：②塔板理论的结论注意：色谱条件相同时，以不同组分峰参数所得塔板数不一样。即理论塔板数与所选择的组分而定。这正说明色谱柱中实际上并不存在塔板这个客观实体，但不妨碍用它来评价柱效。塔板理论的贡献导出了流出曲线的形状；提出了用理论塔板数衡量色谱分离效率的概念；给出了由实验参数求算理论塔板数的公式。塔板理论的缺陷基本假设与事实不完全相符；没有考虑分离过程中组分分子扩散和传质动力学等动力学因素的影响。因而无法回答色谱峰展宽的原因，即影响色谱柱分离效率的原因③塔板理论的贡献和缺陷①速率理论中塔板的概念继承塔板理论中塔板的概念，从动力学观点出发，给塔板和塔板高度注入了新的物理意义。色谱进样后，组份谱带在流动相的携带下，在两相间不断分配并向下游移动的过程中，组分分子在行走路径、扩散方向、溶入固定相深度方面的随机性，它们在柱内的停留时间有一定的差异，这使得组分谱带在移动的过程中不可避免地增宽。

(2)速率理论谱带增宽的程度：定量表示方法：色谱峰标准偏差σ

决定σ的因素色谱柱的好坏等分离条件组份谱带在色谱柱内的移动距离有关，移动的距离越长，

越大。

用单位柱长上色谱谱带的扩张程度作为柱效的量度，即将塔板高度定义为：②范氏速率方程

1950年，荷兰化工师VanDeemter用色谱动力学观点研究气相色谱峰展宽的因素时，导出了速率方程，又称VanDeemter方程:

式中：A：涡流扩散引起的展宽；B/U：分子扩散引起的展宽；CU：传质阻力引起的展宽。涡流扩散项A（eddydiffusion）在填充色谱柱中，流动相中的组份分子碰到固定相就会改变流动方向，分子在流动相形成紊乱的类似涡流的流动模式，由于柱内固定相的不均匀性，各个组分分子所经过的路径也不相同，有的分子超前，有的分子滞后，使色谱峰由带状扩张成正态分布形的色谱峰。涡流扩散项A与流动相流速无关分子扩散B/U(moleculardiffusion)

由柱内浓度梯度引起的分子扩散：流动相流速越小，组分在柱内滞留时间越长，分子扩散项的影响越大。所以，分子扩散项与流动相线速成反比，B/U流动相传质过程：组分分子从气相移动到固定相表面的过程固定相传质过程：组分分子从流动相-固定相界面移动到液相内部，达到分配平衡，然后又返回两相界面的传质过程。由于传质平衡不能瞬间实现，由流动相进入固定相的组份分子回到两相界面时，已落后于滞留在流动相的该组分其他分子，引起谱带扩张。

传质阻力CU（masstransferresistance）低流速时——分子扩散项B/U起主导作用高流速时——传质阻力项C∙U

起主要作用。H~U曲线上有最低点，该点塔板高度最小，对应为最佳流速Hopt

。采用Hopt处的Uopt分析速度太慢，常采用稍高的流速。综合结果—H~U曲线3.分离度（resolution,

R）前面介绍的两个概念：选择性因子α:色谱系统对两组分保留作用的差异理论塔板数N：色谱系统的分离效率（即柱效）两者均未涉及相邻两组分能否分离的问题。分离度R，衡量两相邻色谱峰分离程度的指标，定义为：注意：R无量纲，计算时t与W的单位要一致（1）分离度的定义R<1.0：两色谱峰有明显重叠；R=1.0时两峰分离可达98%；R=1.5时两峰分离可达99.7%，分离基本完全。将R≥1.5作为完全分离的底限值。

从分离度表达式可以清楚地看到：难分离物质对的分离色谱过程中两种因素的综合影响，保留值之差：色谱过程的热力学因素；谱带宽度：色谱过程的动力学因素。分离度是衡量色谱分离过程的总效果的指标，影响因素众多。可用分离方程考察相邻两组分的分离度受理论塔板数N、第2组分容量因子k2、相邻组分的选择性因子的影响情况。(2)改善分离度的途径①塔板数N的影响增加柱长N能提高分离度R值，但将增加分离所需时间。从另一个角度考虑：∵L=N×H

∴改善色谱条件减小H值，对改善R更有效。②容量因子k的影响提高k有助于分离，由于，将明显增加分离时间。但根据R与k的关系，当k

>10后对R的提高不再明显，而对t的影响依旧。故通常k取2~10。与固定相和流动相性质相关，对分离度的影响最为直接。若维持R=1.5不变，则不同所需N为：

=1.01.051.02N=500182010750可见对分离度的影响至关重要③选择性因子的影响

综合考虑选择合适色谱柱，改善为首要任务，同时优化实验条件提高N是重要手段，k的影响也不能忽视。因气体流动相与样品组分分子间的作用非常小，流动相除了起运载作用外对组分几乎没有选择性，所以气相色谱的分离主要决定于组分与固定相分子间作用力的差异。气相色谱法要求组分以气体形式进行分离，所以只适合分离分析沸点低、易气化的化合物（b.p.<300℃）。10.3气相色谱法GasChromatography根据各部分的功能，气相色谱仪可以分为：气路系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理和控制系统等五大系统。气相色谱仪的流路示意图10.3.1气相色谱仪组成：高压气源：钢瓶或气体发生器压力调节器：减压阀气体干燥净化器:分子筛、硅胶、活性碳流量控制器：稳压阀/稳流阀/电子稳压(流)阀1．气路系统（供气系统）功能：

将气源的高压转换成合适的低压，除去气源中的微量水分和杂质，以稳定的流量进入色谱仪，保证分离分析顺利进行。类别：单通道系统：结构简单，适合于恒温操作双气路系统：能用于程序升温操作，并可减小噪声和漂移，使基线稳定。功能：将一定量液(气)体样品注入气化室，样品瞬间气化，由载气送入色谱柱进行分离。组成结构气化室：使液态样品迅速气化的装置。气化室须有独立的加热装置；在进样端口采用耐高温的硅橡胶隔垫密封；2．进样系统进样器注射器：分1L、5L、10L、50L等六通阀气相色谱柱可分为填充柱和开口毛细管柱。（1）填充柱由不锈钢或玻璃制成，内径一般在2~4mm，长度1~4m，外形有U字型和螺旋型。柱内充有颗粒状固定相。填充柱的优点是柱容量大，允许的进样量大。3.分离系统(色谱柱)（2）毛细管柱外表面包裹了一层聚酰胺的石英毛细管内径0.25~0.53mm，长度在10~60m，由于聚酰胺保护层的作用，毛细管有一定的弹性，可卷成螺旋状毛细管柱的特点：分离效率高柱容量小填充柱和毛细管柱的基本性质和特点柱参数毛细管柱填充柱柱长(m)15~1001~5内径(mm)0.1~0.72~4填充物粒度无填充物，或2m100~200m总柱效(板数)几万到几十万1500~8000柱前压(MPa)0.05~0.10>0.20样品容量(L)小于0.01大于0.5适用试样复杂的多组分简单的多组分分流进样毛细管柱细而柱容量小，直接注射器取样体积极小而误差很大，须采用分流进样：常量取样，气化室出口分流，很少部分进柱分析，绝大部分则放空。这两部分气流比称为分流比。柱后尾吹：柱尾的气体流量太小，与检测器要求的流量不匹配，在柱后汇入辅助气流。毛细管柱的分流进样和柱后尾吹4．检测系统组成：检测器信号放大器记录器(色谱工作站)功能：将组分的浓度信号转变为易于测量的电信号，经放大后记录为色谱图。种类：气相色谱仪常用的有：热导池检测器（TCD）氢焰离子化检测器（FID）电子捕获检测器（ECD）优良的检测器应尽量满足以下要求：灵敏度高、稳定性好---便于微量、痕量分析；死体积小，响应时间快---足快速分析要求；线性范围广---便于定量分析；对温度、流动相流速及组成变化等不敏感。

(1)检测器的性能指标灵敏度（sensitivity，S）——进入检测器的组分浓度(或质量)的增量ΔQ引起检测器响应信号ΔR的变化率。②线性范围线性范围——被测物质的浓度（质量）与检测器响应信号成线性关系的范围①检测器的灵敏度

检测器没有组份进入时，也会产生一定的信号，称为噪音。噪音的存在，会淹没低浓度组分所产生的色谱峰。因此，衡量检测器所能测到的组分最低浓度（质量）的指标为检测限（detectionlimit）。使检测器产生三倍于噪声的水平的组分浓度（或质量）称为检测器的检测限(亦称敏感度)

③检测器的检测限检测限的计算式：基本结构：(2)热导池检测器(thermalconductivitydetector,TCD)化合物λ×105(373K)化合物λ×105(373K)化合物λ×105(373K)空气31.4氢223.58氦174.17氮31.4氧31.82一氧化碳30.14二氧化碳22.19甲烷45.64乙烷30.56正戊烷22.19乙烯30.98乙炔28.47苯18.42甲醇23.03乙醇22.19丙酮17.58氯乙烷17.17乙酸甲酯17.17一些气体和有机化合物蒸气的热导系数[单位：J·cm-1·s-1·K-1]工作原理利用不同气体的导热系数不同（带走热量的能力不同）,而使电热丝电阻不同产生电信号

仅有载气流经时，参考臂和测量臂的热丝表面被带走热量相同，两热丝阻值相同，根据电桥平衡原理，A、B间的电位差ΔV

=0，形成基线；当样品组分进入测量臂时，因其导热系数与纯载气不同，而从热丝表面带走热量不同，热丝阻值变化，电桥失衡，AB两端电位差ΔV≠0，产生信号。惠斯登电桥平衡条件特点和适用范围

通用型

检测器结构简单，灵敏度适宜(g/mL级)稳定性较好，线性范围较宽。广泛用于有机物、无机气体等的检测构造组成离子室：金属圆筒+基座，既防外界气流对火焰的扰动，又可屏蔽电磁波的影响。离子头：由陶瓷喷嘴、金属环状发射极（+）、筒状收集极（-）构成，两极距离≥10mm。直流电场：两极间电压约为±100~±300伏。(3)氢火焰离子化检测器(flameionizationdetector,FID)原理

被测有机物在氢火焰中燃烧产生电子和正离子，在外加直流电场作用下向收集极和发射极定向流动，形成信号电流(与引入氢火焰中有机物的量成正比，达10-7A甚至更高），经放大后得到色谱数据。特点和适用范围灵敏度高(ng/ml级)；响应快；线性范围宽；对操作条件(如载气流速，检测器温度等)的要求不严苛；稳定可靠只适用于微量有机物的气相色谱分析。结构：(4)电子捕获检测器(electroncapturedetector,ECD)在离子室内安装有β射线源和电极，以信号收集极作为阳极，安装于气体入口处，以放射源为阴极。原理：进入离子室的载气经放射源β粒子轰击下电离成正离子和自由电子，在直流电场作用下形成基流I0。样品进入离子室时，电负性物质捕获电子而使基流减小(降低值与样品浓度成正比)形成响应信号。N2N2++eAB+eAB-+EAB-+N2+

N2+AB特点和适用范围高选择性检测器，对含卤素、磷、硫、氧等元素的化合物有很高的灵敏度，对大多数烃类没有响应。早期，记录仪绘出色谱图，人工测量和计算所有数据。目前，色谱工作站不仅能处理谱图和峰数据，进行定性、定量分析，还具有控制仪器参数(温度、载气压力和流量等)的功能。5．数据处理和仪器控制系统液体固定相的形成填充柱：在惰性的多孔固体颗粒(载体)表面以涂布或化学键合的方式覆盖一层高沸点有机化合物(固定液，工作温度时呈液态)作为固定相毛细管柱：直接将固定液固定在极细内径的玻璃管内壁上。

以下主要介绍填充柱的固定相10.3.2气相色谱的固定相1.气液色谱固定相气液色谱的分离机理：依据组分分子在气体流动相与液体固定相之间分配作用的大小分离。基本要求：表面积大，孔径均匀：承载更多固定液，并使液膜薄而均匀。惰性好：能附着固定液，但不和样品反应。粒度均匀：便于填充热稳定性和机械强度好：不易破碎种类：分为硅藻土和非硅藻土两大类，(1)载体市售硅藻土载体因制备工艺有别而分为红色(含铁多)和白色两类品种特点承载固定液用途机械特性比表面催化性能红色好大(4m2/g)强多(可达40%）分析非极性样品白色差小(1m2/g)弱少(可达20%）分析极性样品①硅藻土载体硅藻土载体使用前应该经过酸洗、碱洗、硅烷化等表面处理，以除去的表面的活性作用点。高分子小球(苯乙烯及衍生物与二乙烯苯聚合)既可用于气液色谱的载体，又可用作于气固色谱分析。广泛用于各类样品的分析。聚四氟乙烯载体：用于分离强腐蚀性和强极性化合物。玻璃微球：低液载比，能在较低温度下分离沸点较高的化合物。②非硅藻土载体基本要求对组分有良好的选择性：使样品中各组分能彼此分离液态且蒸气压低：减少色谱柱固定液的流失热稳定性：保证性能化学惰性好：不与组分、载体、载气发生不可逆的化学反应固定液与组份间的作用力定向力：极性分子之间永久偶极矩之间的作用力诱导力：极性分子与易极化的非极性分子之间作用力色散力：非极性分子之间作用力氢键力：易生成氢键的分子之间作用力(2)固定液固定液的相对极性相对极性值的测定：选3根柱子：待测柱强极性柱：β,β’氧二丙腈为固定液非极性柱：角鲨烷为固定液选两个评价物：苯和环己烷，测定它们在每根柱上的相对保留值计算相对极性：

固定液按极性分类将相对极性值大小每20为一级分类固定液相对极性级别固定液相对极性级别角鲨烷0-1β-腈乙基（25%）甲基硅橡胶（XE-60）52+3阿皮松7-8+1聚乙二醇-20000（PEG20M）68+3甲基硅油或甲基硅橡胶（SE-30，OV-1）13+1聚乙二醇-60074+4己二酸二辛酯21+2己二酸二乙二醇酯80+4邻苯二甲酸二壬酯25+2双甘油89+5聚苯醚OS-12445+3β,β’－氧二丙腈100+5常用固定液的相对极性数据固定相众多，实验室不可能也没必要配全。推荐常用固定相主要有12种，而其中的4种已基本能涵盖绝大部分样品的分析需求：

SE-30

非极性，分析烃类等非极性化合物OV-17

弱极性，分析中等极性化合物

PEG20M

氢键型，含羟基化合物

DEGS（聚丁二醇二乙二酸酯）

强极性，分析极性化合物

固定相的选择分离机理和适用范围根据气体分子在固体表面吸附能的差异进行分离主要用于分离气态烃类和永久性气体。特点分离性能与制备和活化条件有很大关系，重现性差表面有多种活性质点，具有不可逆吸附或催化功能，很难分离极性组分和复杂组分。2.气固色谱固定相固体吸附剂活性炭——非极性，分析永久性气体活性氧化铝——中等极性，分析气体混合物硅胶——氢键型，分析小分子烷烃分子筛——强极性，永久性气体合成的树脂GDX1型和2型——非极性，苯乙烯与二乙烯苯共聚而成；GDX3型和4型——极性，分别为三氯乙烯和含氮杂环单体与二乙烯苯共聚而成。主要的固体固定相化学键合固定相

制备：将含有一定官能团结构的固定液分子，以共价键的方式键合到载体表面，形成固定相。特点：固定相几乎不会流失。整体柱制备：在色谱柱内灌入高聚物单体、交联剂、引发剂，以适当的方法在色谱柱内（原位）引发聚合反应，制备成多孔性的连续床固定相。特点：具有整体的三维网状多孔结构，且孔眼的大小可以在合成中加以控制，比常规填充柱式固定相具有更好渗透性和稳定性。3.特种固定相色谱分析针对试样的特点，合理选择实验条件，使试样中的待测组份“出得来，分得开，走得快”气相色谱需要优化的操作条件主要有：色谱柱的种类和柱长柱温载气种类及流速检测器种类及工作条件进样量10.3.3气相色谱分离条件的选择气相色谱实验室常备的柱子有非极性柱——SE-30，组分按沸点由低到高的次序出峰；弱极性柱——OV-17；氢键型柱——聚乙二醇-20M，极性和氢键力共同作用；强极性柱——聚丁二醇二乙二酸酯(DEGS)，按极性由弱到强的次序出峰。1.色谱柱不同检测器适用于不同的载气

TCD——H2的导热系数大，灵敏度高；N2安全FID——都可以,但N2安全ECD——需要有稳定的基流，宜用N2

载气种类对柱效的影响重载气(如N2)适合低线速分轻载气(如H2)适合高线速分离最佳线速实际操作时稍高于最佳流速，以提高分离速度。2.载气种类和线速的影响3.柱温较低柱温：有较大的分配系数，选择性好提高柱温：可改善气液传质速度，分析速度快，但加剧纵向扩散效应，使柱选择性变坏。一般样品柱温在各组分平均沸点附近。以恒温色谱方式处理。宽沸程样品宜用程序升温法进样后，在进样口气化的组分在“冷”色谱柱头液化(冷凝)，并随柱温的逐步升高而依次离开柱头开始在柱内分离。等温色谱分离——田径运动员同时出发程序升温分离——冰雪运动员先后出发正烷烃等温和程序升温的色谱分离效果比较1.丙烷(b.p.-42.1℃)；2.丁烷(-0.5℃)；3.戊烷(36.1℃)；4.己烷(68.7℃)；5.庚烷(98.4℃)；6.辛烷(125.7℃)；7.壬烷(150.8℃)；8.癸烷(174.1℃)；9十一烷(195.9℃)

1．定性分析鉴定试样中未知成分是什么常用色谱定性方法保留值定性经验规律定性多柱定性仪器联用法定性等其中保留值定性和仪器联用法定性最为常用。10.3.4定性定量分析可利用的色谱保留值：保留时间、相对保留值、保留指数等

①保留时间比较法比较相同操作条件下试样与标准品之色谱图中相关峰的保留值，从而确定试样中是否含有标准品中所含的物质。该法仅适用于试样组成基本已知的简单体系。（1）利用保留值定性在柱温、固定相性质不变时组分对特定参考物的r值不受气相流速、进样量等实验条件的影响，可以作为定性指标。计算出r值后与文献值进行比对，可作出初步判断。②

相对保留值r定性统一用正构烷烃作为系列标准物，以解标准物难得之困将正构烷烃的保留指数人为规定为碳原子数z100组分保留指数I为：然后将计算值与文献值比较进行初步确认。③利用保留指数(KovatsIndex)定性如比较不同选择性检测器对同一样品所得的色谱图，还可以得到更多的定性信息，如FID检测器：仅有机化物有信号，无机气体无信号ECD检测器：只对负电性强的物质有信号。与质谱（见10.5节）、红外、核磁等结构分析仪器联用，直接获得每个色谱峰的物质结构（2）仪器联用法定性试样试样中的组份

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCD气相色谱分离(GC)质谱鉴定(MS)色谱图每个峰的质谱图BACD气相色谱与质谱联用定性分析示意色谱定量分析：根据组分检测响应讯号的大小，定量确定试样中各个组分的相对含量。定量分析的依据：色谱峰的峰面积或峰高与待测组份的浓度成正比。定量分析需要做的几件事：峰面积的确定校正因子定量计算方法2.色谱定量分析方法（1）色谱峰面积的测量峰高乘峰半高宽法：Ai

=1.065hW1/2

色谱工作站直接进行积分得出峰面积值。（2）定量校正因子校正因子的意义等量的不同物质在同一检测器上响应值可能不同，仅以峰面积（或峰高）计算含量将引入误差。要知道峰面积A与浓度（质量）m之间线性关系的比例系数：

m=f’A相当于分光光度法中郎伯-比尔公式：

A=εbc中的ε

绝对校正因子f：进入检测器中某组分的量mi与检测器产生的色谱峰面积A间的关系为：mi=f’iAi

或f’i=mi/Ai

相对校正因子fi：待测物与标准物的绝对校正因子之比：校正因子有多种：用相对校正因子更准确①归一化法基本依据：试样中所有组分之和为100%。计算公式：含有n个组分的试样中组分i含量为（3）

定量校正方法适用范围：试样中所有组分能全部流出色谱柱，且在检测器中都能产生相应信号时可采用归一化法定量。基本依据：色谱峰面积与进样量成正比操作方法：一系列（>=5个）标准样品色谱分析后，做待测组分的峰面积~浓度的标准曲线；相同操作条件下，色谱分析测得试样中待测组分的峰面积，在标准曲线上查得试样中待测物的浓度。适用范围：通用，尤其是工厂的日常控制分析。准确性主要取决于进样量的重复性和操作条件的稳定性。②标准曲线法(外标法)基本依据：样品组分与恒定量内标物的相对峰面积比与组分含量成正比。操作方法：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS

，进样分离，得到色谱图计算式③内标法试样中不存在；化学结构与待测组分相似(保留值相近)；能与被测组分完全分离。对内标物的要求：适用范围：不能使所有组分都出峰、或只要求定量分析复杂样品中某几个组分时。实验条件（包括进样量）微小变化对定量结果无影响。

例如：对羟基苯甲酸酯(尼泊金酯)是一种新型食品防腐剂，在食品分析中，可以用羟基苯甲酸丙酯为内标，测定羟基苯甲酸酯。方法特点适用计算公式外标法以待测组分标准溶液的峰面积对浓度作图而得到标准曲线，查对后定量；需严格控制进样量和色谱分离条件；只要待测物能出峰，其他组分能否出峰无。各监测部门和厂矿企业的常规分析。可用一元线性回归曲线法查对未知组分的含量。归一化法要求样品中所有组分都出柱，并在检定器上有响应(出峰)，且各组分的校正因子已知。不必称样和定量进样，分离条件微小变化影响不大；计算简单。多组分的常规分析。内标法在样品中加入一定量的纯内标物，根据内标物和待测组分的校正因子和内标物质量，求出待测组分的含量。不要求所有组分都出峰，但要求能选到一个合适的内标物(样品中不存在，保留值和响应值均与待测组分相近)要精确称量，较麻烦。无标准物且待测组分不多的情况。三种定量方法小结分离效率高：填充柱的理论塔板数可达几千；毛细管柱则可高达几万到几十万，能分离含几百个组分的复杂物质。灵敏度高：可检测10-11~10-13克的痕量组分，满足环境监测、农药残留等日常检测的需要。分析速度快：几分钟至几十分钟便可完成一次复杂样品的分析。仪器设备相对简单：设备和操作费用较低，易于普及。对环境较为友好：几乎不用有机溶剂。

10.3.5气相色谱法的特点和应用应用实例1：汽车内空气中有害物质的测定A

色谱条件：50m×0.32mm(id)×0.25µmSE-30毛细管柱。柱温：50℃保持5min，以5℃/min升至220℃，保温10min。检测器：FID应用实例2：南极海水中有机氯农药残留量的测定30m×0.32mm(id)×0.25µm的OV-17毛细管柱；检测器：FID

柱温：70℃保持1min，以15℃/min升至220℃，保持10min；八组分依次为:-HCH、-HCH、-HCH、-HCH、,’-DDE、,’-DDD、,’-DDT、,’-DDT10.4高效液相色谱分析

(HighPerformanceLiquidChromatography)

高效液相色谱（HPLC）是以液体作为流动相、用高压泵驱动流动相、采用柱后在线检测的液相色谱分离分析法。

高效液相色谱法的特点与气相色谱比较流动相对组分有很大的选择性

可以通过调节流动相的极性、pH、离子强度等改变流动相的洗脱强度。气相色谱的流动相只起运载作用，对组分没有选择性分离不受待测物沸点高低的限制，应用范围广。适合于沸点较高、热不稳定有机及生化试样的分离与分析常在室温下工作与经典液相色谱法相比高效液相色谱与经典液相色谱法相比较，具有“四高”特点：高效，高压、高速、高灵敏度。HPLC是分离与检测相结合的仪器分析法经典液相色谱与高效液相色谱的异同高效：采用微米级的、粒度均匀的固定相，传质阻力小，柱效高塔板数达到103-104数量级高压:固定相细，对流动相的渗透能力差，需用高压泵驱动,柱压>150大气压高速:流动相线速快，1mL/min，分析速度快，几十分钟完成一次分离分析高灵敏度:配置高灵敏度检测器，在线检测，分析灵敏度高，检测下限可达10-9-10-11g

上述四大特点相互关联高效液相色谱的应用

HPLC几乎可以分离分析除永久气体之外的所有化合物，在实际应用中主要应用于分离分析分子量较大，沸点较高的各类小分子及离子型化合物，还可以用于分离及分析合成高分子和生物高分子化合物。目前HPLC主要应用于制药、食品、医学、生物、化工、环境等领域。HPLC分离四种生物碱色谱图色谱柱：VenusilXBPC8(4.6×250mm，5µm，100Å)

流动相：（20mMKH2PO4，pH3.0）：乙腈=90：10（v/v）流速：1.0mL/min。柱温：27℃。进样体积：2μL。检测波长：254nm10.4.1影响HPLC分离的主要因素

柱效

不同粒径固定相的HPLC范氏曲线图HPLC的VanDeemter方程:从左下图的可见：范氏曲线中无最低点，是因为HPLC中分子扩散项可以忽略，因此HPLC的范方程可写为：固定相颗粒的直径对HPLC柱效产生极大的影响小颗粒固定相不仅有利于提高柱效，同时还有利于实现高速分离。如，在最近发展起来的超高压液相色谱中（UPLC）：粒径减小到1.7um,而柱效可达到100,000到300,000塔板。依然用色谱分析方程来讨论选择性因子α选择性因子α对相邻组份的分离度起十分关键的作用，α越大越有利于分离。在HPLC中，流动相的组成会显著影响组份在两相间的分配系数，进而影响两组份的选择性因子，而且调整流动相的组成比较方便，因此改变流动相组成是改变α的最重要手段。容量因子k目标组份分配比k应该控制在2～10之间。在HPLC中，可以通过改变流动相的组成和固定相种类改变目标组份的分配比。HPLC柱的温度对分配比的影响较小，多数情况下，HPLC的色谱柱处于室温状态。10.4.2HPLC仪器

HPLC由输液系统，进样系统，分离系统，检测系统，数据处理及控制系统构成HPLC仪器流程图HPLC的主要关键部件之一，操作压力：150～350×105Pa。要求具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。主要包括串联式及并联式柱塞往复泵。

高压泵1.输液系统梯度洗脱系统等度模式（a）和梯度模式（b）HPLC分离卤代芳香族化合物的色谱图

现代HPLC系统通常具有多个流动相通道，每个流动相通道都配备一个储液瓶，这样可以实现多组份流动相的自动配制和梯度洗脱（gradientelution）。梯度洗脱是HPLC的一种流动相工作模式，指的是在HPLC分离过程中，由两种或两种以上的溶剂构成的混合流动相中，各种溶剂的比例随时间的变化而有规律地变化。梯度淋洗装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:

一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2.进样系统HPLC系统内压力高，不能向气相色谱那样用注射器直接进样，一般采用注射器将试样先充入六通阀以后，在切换六通阀，将试样注入分离系统3.分离系统HPLC柱。柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm，内充固定相（填料）。发展趋势是减小填料粒度、柱径及柱长以提高柱效和分离速度。如超高压液相色谱中（UPLC）：粒径1.7um,柱长30-100mm，柱径2.1mm紫外可见光度检测器（UV-Visdetector）4.HPLC检测器种类：紫外-可见，荧光，差示折光，电化学，质谱

结构原理特点：

通用性好灵敏度较高适用范围：具有紫外可见吸收的化合物光电二极管阵列检测器（diode-arraydetector）

光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。荧光检测器（fluorescencedetector）结构原理特点：灵敏度高选择性好通用性较差适用范围：具有荧光或能衍生成荧光物质的化合物示差折光检测器（refractive-indexdetector）结构原理特点：通用性极高灵敏度低基线受流动相组成的影响适用范围：无紫外吸收基团的物质分析，如碳水化合物等利用纯流动相与含有溶质的流动相具有不同的折光指数对组分谱带进行检测电化学安培检测器（amperometrydetector）结构原理特点：灵敏度高重现性较差不通用适用范围：用于电活性物质的检测在流通式电化学安培检测池中，在工作电极上施加一定的电位（相对于参比电极），当溶质从色谱柱后流入流通池，并与工作电极接触时，在电极表面发生电极反应，产生微电流电导检测器（conductivitydetector）结构原理特点：灵敏度中等适合于离子分析适用范围：检测离子，主要用于离子色谱检测器利用纯流动相与含有溶质的流动相具有不同的电导率对组分谱带进行检测蒸发光散射质量检测器（evaporativelight-scattingmassdetector）

HPLC的发展中受到限制的一个原因,就是缺少象GC中的FID一样的灵敏、通用型的检测器。20世纪80年代后研制的蒸发光散射质量检测器给这一领域带来希望，并向具有真正通用型意义的检测器方向发展。这就是：样品结构不需要具备紫外发色团和合适的折射率；对梯度洗脱和流动相系统的温度变化不敏感；对各种物质的响应因子很接近；在一次分析中可以同时检测主要成分和杂质。工作原理

在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的大小和数量。散射光强度与样品微粒质量的关系为：

I=k

mb式中，m为微粒质量，k、b为实验条件（如温度、流动相性质）决定的常数。因此可根据散射光强度对样品进行定量分析。

散射质量检测和电导测定一样，两者检测的是所有离子的通用性质。对于色谱法来说，作为待测组分的溶质已经分离，关键的问题是如何除去流动相和保证检测条件的一致性。装置及工作过程雾化溶剂蒸发检测特点和适用范围与示差折光检测器相比：灵敏度高对流动相系统温度变化不敏感可进行梯度洗脱与光吸收检测器相比：能解决最困难的HPLC检测问题。如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物的检测减低流动相溶剂的纯度要求无需测定定量校正因子检测器紫外可见示差折光荧光电导安培蒸发光散射响应对象具有紫外可见吸收的化合物通用具有荧光的化合物离子具有电化学活性的化合物通用检测限/gmL-110-1010-710-1310-810-1210-10（g）线性范围10510410~103106106流速敏感性否是否是是否温度敏感性否是否是是否梯度洗脱可以不可以可以有限制脉冲安培型可以可以常见液相色谱检测器的性能比较

10.4.3HPLC分离模式及应用选例

根据溶质的不同保留机理或色谱分离过程的物理化学原理常见的HPLC分离模式包括：吸附色谱(adsorptionchromatography)分配色谱（partitionchromatography）离子交换色谱（ionexchangerchromatography）尺寸排阻色谱（sizeexclusionchromatography）1.液固吸附色谱（LSC）

LSC原理：基于被分离组分与流动相分子在固体吸附剂表面活性位点的竞争性吸附

固定相：硅胶，氧化铝等适用于异构体的分离常用的流动相组分的极性比较LSC常用的流动相吸附色谱应用例举1.1,3,4-甲撑二氧苯丙胺（MDA）；2.2,3,4-甲撑二氧甲基苯丙胺（MDMA）；色谱条件：色谱柱，

150×4.6mm内填充3m粒径的Adsorbospheresilica；流动相，二氯甲烷：乙醇：羟胺

=80：20：1，流速1.25mLmin-1；UV检测，波长280nm。中枢兴奋药MDA与MDMA色谱分离图2.分配色谱原理：基于两相分配系数差异进行分离。目前的分配色谱主要指化学键合相色谱硅胶表面可键合极性基团（如NCCH2CH2OCH2CN)也可非极性基团(如CH3(CH2)16CH3)表面键合固定相硅胶

流动相极性大于固定相极性称为正相色谱（normalphaseliquidchromatography,NPLC)，反之则称为反相色谱（reversephaseliquidchromatography,RPLC）共价键合方式例举R的种类：——反相色谱：烷基（如C8，C18等），苯基——正相色谱：氰基（-C2H4CN），氨基（-C3H6NH2）

二醇基（-C3H6OCH2CHOHCH2OH）

分配色谱常用的流动相请总结正相色谱与反相色谱中组分分子按极性大小出峰顺序规律反相色谱应用例举1．乙酰氨基酚；2.咖啡因；3.苯甲酸；4.水杨酸。色谱条件：色谱柱，100×4.6mm，内填充5m粒径的AdsorbosilC18固定相；流动相，水：甲醇：冰醋酸

=69：28：3，流速1.5mL/min；柱温，45C；检测器，UV-Vis，波长275nm。HPLC反相分配色谱分离乙酰氨基酚、咖啡因等药物的色谱图反相色谱是HPLC中应用最广的分离模式。适用于除强极性化合物之外的多类物质的分离正相色谱应用例举1.三甲丙咪嗪；2.多虑平；3.阿米替林；4.丙咪嗪；5.去甲多虑平；6.去甲替林；7.脱甲丙咪嗪；8.普罗替林。色谱条件：色谱柱，150×4.6mm，内填充5m粒径的氰基键合硅胶固定相；流动相，乙腈：甲醇：0.01mol.L-1K2HPO4=60:15:25，流速2mLmin-1；UV检测，波长215nm。HPLC正相分配色谱分离抗抑郁精神类药物的色谱图正相色谱主要适用于极性化合物的分离开。例如：++++++++++o+o+o+o+o+ooooo+oooooooooo++++++++++++++++++++++o+o+oo+ooooooooooooooooooooooo+o+o+oo+++o+++++++++K+H+淋洗交换上柱分离原理：溶液中的离子与离子交换树脂发生离子交换，利用不同离子静电作用力的差异进行的分离.右图中

+

:代表K+

o:代表H+

交换上柱时，交换剂上的可交换H+被K+所替代；淋洗时，结合在交换剂上的K+被H+所洗脱。

3.离子交换色谱（IEC