分子发光分析法

第五章分子发光分析法

MolecularLuminescence物质分子吸收了外界能量后，从基态跃迁到激发态，当处于激发态的分子以辐射跃迁的方式返回基态时，就产生了分子发光。分子发光包括荧光、磷光、化学发光、生物发光和散射光谱等。一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法荧光分析法的特点：1.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度2.选择性好荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质3.所需试样量少、操作方法简便4.能提供较的多分析参数、信息量大荧光分析法的缺点：应用范围不够广泛第一节荧光分析方法（1）分子能级

每个分子都有一系列不同的电子能级，在每个电子能级中又包含一系列的振动能级和转动能级

基态与激发态单重态与三重态

1.荧光的产生二、基本原理

M=2S+1

S为电子自旋量子数的代数和(0或1)平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低大多数有机分子的基态处于单重态电子激发态的多重度（2）分子能级跃迁基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)速度最快、激发态寿命最短的途径占优势激发态→基态的跃迁

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12―10-14s内转换：相同多重态电子能级中,不同电子能级间的无辐射跃迁通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。10-11―10-13s外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行非辐射能量传递过程辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态(多为S1→S0

跃迁)；10-7～10-9

s磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1→S0跃迁)

电子由S0进入T1的可能过程：

S0

→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1

T1→S0跃迁为禁阻跃迁，故发光速度很慢：10-4～100s

光照停止后，可持续一段时间2.荧光效率及其影响因素（1）荧光效率（量子产率）通常用下式表示：

在产生荧光的过程中，有许多影响荧光强度的过程，如荧光发射、内转换，系间窜跃和外转换。可以用数学式来表达这些关系，得到：其中kf为荧光发射过程的速率常数，ki为其它有关过程的速率常数总和荧光物质必须含有强吸光基团

(a)跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生(b)共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移荧光物质必须具有刚性平面结构（2）荧光与分子结构的关系

分子产生荧光必须具备两个条件：

(c)

刚性平面结构：可减少分子振动，减少与溶剂的相互作用(d)取代基效应：给电子取代基使荧光增强；吸电子取代基使荧光减弱如苯胺和苯酚荧光较强，而硝基苯为非荧光物质（e）重原子效应：卤素取代基随原子序数的增加，荧光减弱，而磷光增强（3)荧光螯合物

不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光（a）溶剂的影响随溶剂极性增强，激发态稳定性增加，荧光增强此外，氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化（b）温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加（c）溶液pH

对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制（d）表面活性剂：胶束增溶、增稳、增敏作用（e）溶液中溶解氧的影响：氧分子的順磁性使激发态单重态向三重态得体系间窜跃速率加大，荧光减弱

(4)影响荧光强度的外部因素根据荧光量子产率的定义，荧光强度If等于吸收的光量Ia与荧光量子产率的乘积：If

=

Ia由于可得当A<0.05时，简化为：3.荧光强度与溶液浓度的关系

对于一给定物质，当激发光波长和强度一定时，荧光强度只与溶液浓度有关：这种线性关系只有在极稀的溶液中才成立。对于较浓的溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度与浓度不成线性关系经常遇到的自淬灭现象有两种：（1）当荧光物质发出的荧光通过溶液时被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。（2）由于激发态分子之间的碰撞，导致非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。荧光猝灭：荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程荧光自猝灭效应：由荧光物质自身引起的荧光强度减弱的现象（1）激发光谱

固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大（2）发射光谱固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)4.激发光谱和发射光谱萘的激发(I)光谱荧光(II)和磷光(III)光谱图荧光发射光谱的普遍特性：（1）Stokes位移

在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失（2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波长无关（3）镜像规则通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分布情况是类似的。因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为相似三、荧光分析仪器

常用于测量荧光的仪器以下五个部件构成：激发光源、样品池、用于选择激发光波长和荧光波长的单色器以及检测器为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行第一单色器或滤光片记录仪第二单色器或滤光片荧光光源激发样品池1.光源

在荧光计中常用卤钨灯作光源荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源可调谐染料激光器2.单色器

荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱3.检测器

荧光计采用光电管作检测器荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器电感耦合器件（chargecoupledevice,CCD)四、荧光分析方法与应用1.

特点：（1）灵敏度高

比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级光度法A=lgI0/I=KC

荧光法I=KC（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱（3）试样量少？(1)无机化合物的分析与有机试剂配合后测量；可测量约70多种元素(2)有机化合物的分析脂肪族有机化合物一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析芳香族化合物多数能发生荧光，可以直接用荧光法测定2.荧光分析法的应用荧光标记物和荧光探针MolecularFormula:C21H11NO5S

CASNumber/Name:

3326-32-7/Spiro(isobenzofuran-1(3H),9'-(9H)xanthen)-3-one,3',6'-dihydroxy-5-isothiocyanato-fluorescein-5-isothiocyanate(FITC)

一、基本原理1.磷光的产生和磷光强度

磷光是由处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。与荧光比较，磷光的特点：（1）磷光辐射的波长比荧光长（2）磷光具有较长的寿命（3）磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子非常敏感第二节磷光分析法当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之间的关系为：式中：Ip

为磷光效率，Io为激发光的强度人为磷光物质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程。在一定的条件下，、、、b均为常数，因此上式可写成：根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线2.温度对磷光强度的影响：随着温度的降低，磷光逐渐增强3.重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→T1的体系间窜跃概率增大，有利于增大磷光效率。4.室温磷光（1）固体基质：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。（2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。（3）敏化磷光:激发三重态将能量转移于另一易发磷光的受体，让其发磷光1．样品池盛试液的石英液槽需放置在盛液氮的石英杜瓦瓶内2．磷光镜利用磷光镜不仅可分别测出荧光和磷光强度，而且可以测出不同寿命的磷光二、磷光分析仪器

荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光a.低温杜瓦瓶b.斩光片第三节化学发光与生物发光分析

一、概述

化学发光指由化学反应能，激发物质分子所产生的光辐射。生物发光指生物体系中的化学发光。

优点：灵敏度高、仪器简单、线性范围宽、分析速度快。缺点：能用于化学发光与生物发光分析的试剂相对有限，对发光机理的研究较少。生物发光具有很高的发光效率。常用的化学发光效率较低，一般在0.01以下。

萤火虫植物Pyrocystis

fusiformis

1.化学发光反应的条件：（1）化学反应必须能放出足够的能量；（2）化学反应所释放的能量能够用于产生激发态分子；（3）处于激发态的分子以辐射跃迁的形式返回基态。二、化学发光的基本原理

A+B→C*+DC*→C+

hν化学发光效率φCL定义为：生成激发态分子的化学效率φr：生成激发态分子的发光效率φf：

2.化学发光效率和发光强度化学效率φr主要取决于发光所依赖的化学反应本身；而发光效率φf既取决于发光体本身的结构和性质，亦受环境的影响。

对于一级动力学反应，化学发光强度ICL与反应速率有如下关系：积分，得：

由上式可知：在一定条件下，发光总强度与分析物浓度成正比。因此，根据已知时间内的发光总强度可进行化学发光分析的定量分析。3.化学发光反应的类型（1）液相化学发光

鲁米诺+H2O2

产物+hv

鲁米诺在碱性溶液中被H2O2、I2等氧化剂氧化，可产生最大波长为425nm的光辐射。(2)气相化学发光

在气相中，O3能氧化NO、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化SO2、NO、CO等产生化学发光。例如：a.一氧化氮与O3的发光反应

NO+O3

→NO2*

NO2*→NO2+h

发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与CO的发光反应：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h

发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/cm-3。三、化学发光分析的仪器1.分立取样式仪器分立式化学发光分析仪是一种静态下测量液相化学发光信号的装置。特点：仪器简单、灵敏度高，可用于反应动力学的研究。缺点：重复性差，测量的精密度不高，难于实现自动化，分析效率也比较低。放大器数字显示器高压稳压电源记录仪分立取样式化学发光仪器示意图1－反应器2－反应池3－恒温水箱4－贮液管5－滤光片6－光电倍增管驱动装置发光试剂2.流动注射式仪器流动注射式化学发光分析仪示意图用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大。载流样品采样阀反应池光电倍增管记录显示废液四、化学发光分析的应用气相化学发光已广泛地应用于大气中O3、NO、NO2、H2S、SO2、CO等组分的监测。鲁米诺-H2O2化学发光反应能被许多过渡金属离子所催化，利用这一性质，已建立了Co2+、Cr3+、Cu2+、Au3+、Ag+、Fe(Ⅱ、Ⅲ)、Ni2+、Mn2+、Os(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)、Ru(Ⅳ)、Ir(Ⅳ)、Rh(Ⅲ)、v(Ⅴ)等金属离子的化学发光分析法此外，Hg2+、Ce(Ⅳ)、Ti(Ⅳ)等金属离子和CN-、S2-等非金属离子对鲁米诺-H2O2体系的化学发光具有抑制作用，利用抑制作用也可对这些离子进行测定。鲁米诺-H2O2体系也用于化学发光法测定许多生化物质，如甘氨酸、铁蛋白、血红蛋白、肌红蛋白等。特别是与酶反应结合，可用于分析葡萄糠、乳酸、氨基酸等。五、生物发光分析法

在生物发光分析中，通常同时涉及到酶促反应和发光反应。这类发光分析法不仅灵敏度高，选择性也很高。例如三磷酸腺苷（ATP）的测定，就是生物发光分析的成功实例。在pH为7-8的介质中，在荧光虫素酶（E）和Mg（Ⅱ）离子的存在下，荧光虫素（LH2）与ATP反应，生成磷酸腺苷（AMP）荧光虫素和荧光虫素酸的复合物及镁的焦磷酸盐（ppi）。