真菌操作常规20230307

真菌鉴定操作常规标本的采集和处理1.皮肤、指甲、毛发和组织在收集标本前用75%酒精消毒病变部位。如果损害处已用了软膏、冷霜或粉剂应事先清洁。取材应用钝手术刀刮取表皮皮屑，或用透明胶带粘取皮屑直接移至载玻片上，水疱取疱壁组织，脓疱则取脓液。皮肤粘膜交界处或菲薄的皮肤部位如龟头、大阴唇、口周、肛周等处以浸有生理盐水的湿棉拭子，檫拭局部后送检。指甲标本应取变色、萎缩或变脆的部位，以钝手术刀刮除表层，采集病甲边缘下病甲置载玻片上，滴封固液，微加热，使甲溶解。毛发标本应取无光泽、脆而松动，根部折断的毛发。毛发置载玻片滴加10%KOH溶液，微加热使角质溶解。组织取病变部位，置无菌生理盐水中送检。以无菌镊子和剪刀剪碎后进行培养或镜检，避免使用组织研磨器对真菌菌丝的折断及机械性损害皮肤、指甲、毛发和组织标本一般采用直接镜检。2．眼、耳部标本怀疑真菌性角膜炎时，应在手术显微镜下以眼科小匙刮取溃疡的基底和边缘部位。怀疑真菌性内眼炎时，应尽可能收集玻璃体液。结膜标本可用消毒生理盐水浸湿的棉拭子拭取。耳部标本应从耳道中刮屑取材，也可采用拭子取材。3．脑脊液标本取3-5ml经腰穿获取的脑脊液标本至无菌管内立即送检。将标本2500rpm离心15分钟，上清液可用于血清学实验，沉淀部分用于培养和涂片镜检。4．血液、骨髓标本抽取5－10毫升血液或骨髓注入需氧菌血培养瓶中，尽快送检。如血培养仪器报告阳性，及时取样接种于沙氏培养基并涂片革兰染色镜检，如发现真菌孢子报告病房并登记。5．体液（包括胸腔、腹腔及关节腔积液）：将无菌抽取胸水、腹水和关节腔液及时送检。标本放无菌离心管中，2500rpm离心10分钟，取沉渣培养或涂片镜检。6．尿液将清洗外阴后留取的中段尿，或经导尿管导出的中段尿，或经皮膀胱穿刺尿立即送检。尿标本应先2500rpm离心10分钟，取沉淀部分进行培养及涂片镜检。7．阴道分泌物或男性尿道标本女性由妇科医师用窥器取阴道或宫颈的伪膜或豆渣样凝块。男性则以尿道拭子伸入尿道2.5cm处旋转取出尽可能多的尿道脱落细胞及分泌物，立即送检。8．呼吸道标本（咳出痰、诱导痰、气管吸痰、支气管肺泡灌洗液、肺组织）取清晨新鲜咳出的痰，如病人不能咳痰，可用支气管盐水诱导咳痰，插管病人采用气管吸出痰，必要时在纤维支气管镜检的同时获取支气管肺泡灌洗液或支气管毛刷标本。对于局灶性肺部病变，高度怀疑肺部真菌感染的患者可经皮穿刺，在影像学指导下获取病变部位的肺组织。9．脓液或溃疡、窦道、瘘管等标本用75%酒精消毒病变部位后刮取脓液，窦道壁及周围尽可能深的部位，若脓肿未破，应以无菌注射器抽出脓液送检。注意寻找并收集脓液中或窦道开口部位的颗粒送检。10．大便留取新鲜大便，尽快送检。收到标本后，应根据申请项目将检验信息录入计算机并获取检验号记录在申请单上二、真菌的显微镜检查：1．直接检查：将待检标本（皮肤、甲屑、毛发或组织）置载玻片上，加一滴载液（根据不同需要选用相应载液），盖上盖玻片，放置片刻或在火焰上快速通过2-3次（不可煮沸），轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用吸纸吸去周围溢液，置显微镜下镜检。检查时先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察菌丝和孢子的形态、特征、位置、大小和排列。结果报告依据镜下情况报：“找到真菌孢子”或者“找到真菌菌丝”或者“找到真菌菌丝及孢子”。如未找到真菌孢子及菌丝报告“未找到真菌”。注意：毛发标本不可过度施压以免破坏毛发的结构而影响对菌丝孢子与毛干相对位置关系的判断。载液：=1\*GB3①生理盐水：用于稀释标本；=2\*GB3②KOH液：可溶解角蛋白并能清除标本中的脓细胞及其他成分而不破坏菌丝和孢子。一般采用10%-20%溶液。甲屑、毛发等角质厚的标本可用20%溶液；=3\*GB3③乳酸酚棉蓝染色液：可使真菌染成蓝色，镜下易于分辨。丝状真菌直接镜检也使用此载液。2．涂片染色镜检：将标本或菌液均匀涂于载玻片上（必要时加生理盐水或KOH液），火焰固定，革兰氏染色（或其他特殊染色），镜检。如发现真菌报“找到（圆形或卵圆形）真菌孢子（及假菌丝）”。如未找到真菌孢子及假菌丝报告“未找到真菌”。3．墨汁涂片：用于检查新型隐球菌和其他有荚膜的真菌孢子。以优质绘图用黑墨汁少许置载玻片上，加脑脊液沉渣，加盖玻片。稍待2-3分钟，用显微镜先低倍再高倍镜检查；如发现带荚膜真菌孢子，报告“找到隐球菌”。如未找到带荚膜真菌孢子报告“未找到隐球菌”。三、真菌的分离培养：病原真菌除鼻孢子菌和链状芽生菌外，大多数都可人工培养。1．平板培养法：分区划线：呼吸道、脓、血液、体液等标本使用此法培养。用接种环挑取适量标本，在沙氏培养基上分区划线，一般分2-3区。置25℃培养，有真菌生长及时鉴定，5天无菌生长报告“真菌培养未生长”2．试管培养法：=1\*GB3①直接种植：皮肤、指甲、毛发和组织使用此法培养。用无菌镊子夹取待检标本点种在2根沙氏斜面上，可等距离点种几块标本。置25℃和37℃培养，有真菌生长及时鉴定，14天无菌生长报告“真菌培养未生长”。=2\*GB3②脑脊液离心后的脑脊液用接种环接种2根沙氏斜面上，分别置25℃和37℃。有真菌生及时鉴定，14天无菌生长报告“真菌培养未生长”。在沙氏琼脂斜面上菌落初为白色、奶油状，时间长颜色渐变为淡褐色。有的菌株有粘液化趋势，甚至似鼻涕样流向直立的斜面下部。培养物墨汁涂片，不易见荚膜，即使有荚膜也较小。注意：标本应至少接种2支沙氏琼脂斜面，分置于25℃及37不长方可报告阴性。新型隐球菌在上述两种温度下皆可生长，某些非致病隐球菌只在25℃或30℃生长，却不能在37℃生长。但初代培养在25℃生长而于3．玻片培养法（小培养）：=1\*GB3①取无菌平皿倒入适量溶化的培养基（厚约1mm），凝固后以无菌刀片划成1cm2大小的小块。取一小块移在无菌载片上，在小块四周接种待鉴定的菌株，盖上消毒的盖片。放入无菌平皿中的V形玻棒上，底部铺上无菌滤纸，滤纸以无菌蒸馏水湿润（也可用无菌湿棉球替代滤纸保湿）。将平皿置温箱培养。也可以在无菌载片上均匀地浇上溶化的培养基，凝固后接种待鉴定菌株，盖无菌盖片，其余同上。=2\*GB3②待菌落生长后，取出载片直接镜检。也可揭下盖片加95%酒精脱水，干后滴PVA乳酸酚棉蓝液封固，镜检。四、酵母样真菌的鉴定酵母样真菌是以芽殖为主的单细胞真菌，菌落平滑、湿润，乳酪样或薄膜样，无毛样气生菌丝。其中主要致病菌见于念珠菌属、隐球菌属、球拟酵母属、酵母属和丝孢酵母属。按是否具有有性繁殖过程及有性孢子产生的方式、特点、形状和数目，酵母菌可归为3类：1.子囊菌亚门(Ascomycotina)：可产生子囊孢子，如酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属；2.担子菌亚门(Basidiomycotina):可产生冬孢子或掷孢子，如冬孢酵母属、掷孢酵母属等；3.半知菌类(Derteromycotina)：尚未发现有性期，如念珠菌属、隐球菌属、红酵母属、球拟酵母属、丝孢酵母属等。（一）念珠菌属（Candida）的鉴定：1.涂片检查革兰染色镜检可见圆形或卵圆形芽生孢子，一般为念珠菌。亦有从孢子的芽延长而成假菌丝者。有大量假菌丝存在说明念珠菌处于生长活跃状态。大小约3-7×3-14μm不等，单个、成堆或呈短链排列。孢子及菌丝皆为革兰阳性，呈紫色。但有时着色不均，有时少数呈革兰阴性。可报告“找到（圆形或卵圆形）真菌孢子（及假菌丝）”。2．分离培养沙氏平板或斜面以及中国蓝平板上有酵母样菌落长出后，采用以下方法鉴定：=1\*GB3①形态学方法：接种显色培养基（37℃培养）和玉米粉-吐温80培养基（25℃培养），根据菌落形态、显色特征和假菌丝特征鉴定菌种。其中，显色培养上生长绿色菌落为白色念珠菌，蓝色菌落为热带念珠菌，粉红干燥菌落为克柔念珠菌，紫色=2\*GB3②生化方法：形态学无法鉴定的菌种可使用VitekYST鉴定卡以及API20C生化鉴定系统鉴定。操作方法见该产品使用说明书。（二）隐球菌属（Cryptococcus）的鉴定：隐球菌较念珠菌少见，但由新型隐球菌引起的脑膜炎却是一种严重的疾病。该菌存在于鸽粪、土壤、腐烂的水果中，亦见于动物和人体。主要侵犯中枢神经系统，也可以侵及肺、骨、皮肤，甚至引起败血症。其他隐球菌也可引起严重的临床感染。1.镜下特征：=1\*GB3①直接镜检：标本一般为脑脊液、痰或其他分泌物。镜下可见圆形5-12-20μm直径之厚壁芽生孢子，一般少有假菌丝；=2\*GB3②革兰染色：为革兰阳性圆形芽生真菌孢子。注意勿将其误作染料小滴。=3\*GB3③墨汁染色：如有新型隐球菌，在黑色背景下可见圆形孢子，其周围绕以透光的厚荚膜，厚度可与菌体直径相当。菌体的大小和荚膜的宽窄在同一张片子上可有较大不同。有时可看到出芽的孢子。注意切勿将淋巴细胞误认为新型隐球菌。新型隐球菌在墨汁涂片中的形态可归纳为：●圆形或卵圆形的孢子，胞壁厚，边缘清晰，用微调节观察似有双圈；●孢子周围有透亮的厚荚膜，孢子与荚膜之间的界限和荚膜的外缘都非常整齐、清楚；●孢子内有反光颗粒；●有的孢子有芽生出，且芽颈甚细。注意：任何圆形物体边缘模糊，内部无反光颗粒，外部有较窄、内外界线不清的透亮环者，不是隐球菌。但应注意新型隐球菌以外的其他隐球菌也有荚膜。2.生化鉴定：使用VitekYST鉴定卡以及API20C生化鉴定系统，方法见相应产品使用说明书。隐球菌对糖无发酵能力，菌种鉴定依赖于同化试验及其他生化反应。其中尿素酶阳性，而常见念珠菌中绝大多数为阴性，仅解脂念珠菌和部分克柔念珠菌尿素酶阳性。隐球菌中仅新型隐球菌酚氧化酶试验阳性，其他隐球菌阴性。常见隐球菌的生化特性见表3。（三）其他酵母菌的鉴定：尽管临床标本中分离出的致病酵母菌主要是念珠菌属及新型隐球菌，但其他酵母菌也可引起严重感染。如丝孢酵母属、球拟酵母属、汉逊酵母属、红酵母属、毕赤酵母属等。如标本取自正常无菌部位（如血液、胸腹水等）应根据其形态学特征或者使用VitekYST鉴定卡鉴定到种。鉴定步骤见表1、表2及表3。表1.不常见酵母菌鉴定程序表纯培养1%Tween80玉米粉琼脂(25℃假菌丝（＋）（—）(－)关节菌丝(＋)(＋)色素(－)念珠菌属芽生孢子尿素酶荚膜(＋)(－)芽管及厚膜胞子(－)（＋）(＋)(－)隐球菌属酚氧化酶子囊孢子37℃生长(＋)(－)(－)(＋)其白丝地红新其球酵汉他念孢霉酵型他拟母逊念珠酵菌母隐隐酵属酵珠菌母属属球球母母菌属菌菌属属表2．临床可见到的酵母菌各属特性菌种在玉米粉吐温80琼脂上25子囊孢子孢子囊芽管荚膜生长假菌丝真菌丝沿菌丝芽生孢子关节孢子环痕分生孢子厚膜孢子含放线菌酮25在沙氏琼脂37在沙氏肉汤芽裂殖酵母属Blastoschizomyces+++OV+OOOOO++膜样白念珠菌Candidaalbicans+少+OO+OO+O++NSG其他念珠菌OtherCandidaspp.+V少+OOOOVOOOV+V某些种表面生长隐球菌属CryptococcusOOOOOOOO+OVNSG地霉属GeotrichumO+O+OOOOOOOOW膜样汉逊酵母属HansenulaOVOOOO+OOOOVNSG无绿藻ProtothecaOOOOOO+OOVO+V表面生长红酵母属RhodotorulaOROOOOOOOVOV+VNSG酵母属SaccharomycesVOOOO+OOOO+NSG球拟酵母属TorulopsisOOOOOOOOOO+NSG丝孢酵母属Trichosporon++++OOOOOO+V+V膜样+：阳性；O：阴性；V：菌种或菌株变异；W：弱；R：极偶见发育不全的形态；NSG：无表面生长。表3.临床标本中常见酵母菌生化反应菌种同化试验尿素酶硝酸钾酚氧化酶葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖半乳糖蜜二糖纤维二糖肌醇木糖棉子糖海藻糖卫矛醇白念珠菌Candidaalbicans+++*+++链状念珠菌C.catenulata++++季也蒙念珠菌C.guilliermondii++++++++++乳酒念珠菌C.Kefyr+++++*+*+*克柔念珠菌C.krusei++*朗比念珠菌C.lambica++解脂念珠菌C.lipolytica++葡萄牙念珠菌C.lusitaniae+++++++近平滑念珠菌C.parapsilosis++++++皱落念珠菌C.rugosa+++*热带念珠菌C.tropicalis+++++++涎沫念珠菌C.zeylanoides+**+光滑念珠菌C.glabrata++白球拟酵母T.candida++++*+++++++*平托球拟酵母T.pintolopesii+新型隐球菌Cryptococcusneoformans++++++++*++++浅白隐球菌C.albidus++++*+*+++++++*++罗伦特隐球菌C.laurentii++++++*++++*+++浅黄隐球菌C.luteolus++++++++++++地生隐球菌C.terreus++*+*+*++++*++指甲隐球菌C.uniguttulatus+++**+++**+粘红酵母Rhodotorulaglutinis++++*++++++深红酵母R.rubra+++++*++++酿酒酵母Saccharomycescerevisiae++++++*异常汉逊酵母Hansenulaanomala++++++++白吉利丝孢酵母T。beigelii+++++*+*+*+++*+*+*+*茁芽丝孢酵母T.pullulans++++*++*++*+*+*+++白地霉Geotrichumcandidum+++头状芽裂殖酵母B。capitatus++小型无绿藻Protothecawickerhamii++++：阳性；–：阴性；*：菌种或菌株变异五、酵母菌的药敏试验（纸片扩散法）1．美蓝储存液：0.1g美蓝加入20ml无菌水2．培养基：含2％葡萄糖和0.5µg/ml美蓝的M-H琼脂在1000mlM-H琼脂中，加入100µl美蓝储存液和20g葡萄糖，121℃15分钟高压灭菌，水浴55℃倒实验方法：制备菌液：挑取新鲜菌落至适量无菌水中，摇匀成菌悬液。将浊度调致0