离子交换502的课件知识

离子交换层析1离子交换(ionexchange)利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，达到分离的目的。2离子交换树脂的构成具有三维空间离体结构的网络骨架联接在骨架上的活性基团活性基团所带的相反电荷的活性离子（可交换离子）3树脂的网络骨架45离子交换的分类按活性基团分类，可分为阳离子交换树脂(cation

exchange)（含酸性基团）和阴离子交换树脂(anionexchange)（含碱性基团）。具体又可以分为：强阳、弱阳强阴、弱阴67常用的离子交换树脂强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH,-OCH2COOH,C6H5OH等弱酸性基团；强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-ß-羟基乙基胺基；弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；8pH56789交换容量（meq/g）0.82.58.09.09.0羧酸阳离子交换树脂在不同pH下的交换容量H＋和弱酸阳离子树脂的结合力很强，容易再生。910新型离子交换树脂大孔离子交换树脂大孔离子交换树脂具有和大孔吸附剂相同的骨架结构，在大孔吸附剂合成后（加入致孔剂），再引入化学功能基团，便可得到大孔离子交换树脂11大孔离子交换树脂的优点通过在合成时加入惰性致孔剂，克服了普通凝胶树脂由于溶胀现象，产生的“暂时孔”现象，从而强化了离子交换的功能；减少了凝胶树脂在离子交换过程中的“有机污染”现象（大分子不易洗脱）；可以通过致孔剂选择调整孔径大小、树脂的比表面积，以适应不同的分离要求。12和凝胶树脂比较，大孔树脂有以下特点：1。交联度高、溶胀度小，有较好的理化稳定性；2。有较大的孔度、孔径和比表面，给离子交换提供良好的接触条件，交换速度快，有较好的抗有机污染性能；其永久性孔隙在水化作用时起缓冲作用，耐胀缩不易破碎；3。流体阻力小，工艺参数比较稳定。缺点：装填密度小、体积交换量小、洗脱剂用量多，价格高，一次性投资较大等缺点13其它离子交换树脂类型两性树脂：同时含有酸、碱两种基团的树脂；均孔型离子交换树脂：主要是阴离子型凝胶离子交换树脂，孔径均匀，交换容量高、机械强度好；螯合树脂：树脂上含有具有螯合能力的基团，既可以形成离子键，又可以形成配位键；主要用于脱除金属离子；*多糖基离子交换树脂：固相载体为多糖类物质，亲水性强、交换空间大、对生物大分子物质变性作用小。14离子交换纤维素和离子交换葡聚糖

亲水性离子交换剂。都是由葡萄糖聚合而成的大分子物质，在分子中带有很多羟基，通过化学反应可引入活性离子的基团，从而具备离子交换剂的性质。15多糖基离子交换树脂离子交换纤维素

树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类 特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高常用的离子交换纤维素有：

甲基磺酸纤维素、羧甲基纤维素、二乙基氨基乙基纤维素

16CMCCationExchanger17DEAEanionexchanger18离子交换纤维素具有开放性的支持骨架，大分子能自由地进入和迅速地扩散，故对大分子的吸附容量较大。离子交换纤维素上交换基团排列疏散，对大分子的吸附不是太牢固，用温和的条件便可将其洗脱下来，因此不致引起大分子的变性，同时它有较理想的回收率。离子交换纤维素特别适用于分离那些水溶性的大分子物质，如蛋白质、多糖、酸性多糖等。192021交换体系中缓冲盐的浓度不宜高(一般控制在0.001～0.02mol/L之间)，过高会大大减少蛋白质的吸附量。22离子交换纤维素的解吸

升高pH值,降低pH值,增加离子强度

H2N-P表示蛋白质,C表示纤维素。23葡聚糖凝胶离子交换树脂

采用淀粉或蔗糖制备。

骨架为葡聚糖凝胶sephadex，根据功能基团的不同，亦可分为阳离子交换和阴离子交换树脂常用的葡聚糖凝胶离子交换树脂：CM-sephadexC-25、DEAE-sephadexA-25等24

除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高了分离的效率.优点：载体亲水，对生物大分子变性小，分辨率高。比纤维素树脂交换容量大。缺点：洗脱液pH或离子强度变化时，凝胶体积变化大，影响流速。2526离子交换树脂的性能参数交联度交换容量表征骨架性能的参数表征活性基团的性能参数是指交联剂在反应物中所占的质量分数交联度大，树脂孔隙，交换反应速度，选择性。小慢高交联度小，树脂孔隙，交换反应速度，选择性。大快低氨基酸的分离，交联度8%，多肽的分离2~4%每克干树脂所能交换的物质的量（mmol)。决定于网状结构中活性基团的数目。交换容量由实验测得27影响离子交换选择性的因素水合离子半径：半径越小，亲和力越大；离子化合价：高价离子易于被吸附；溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量；离子强度：越低越好；有机溶剂：不利于吸附；交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少；树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；28RSO3-H++H3+NR1COO-RSO3-H3+NR1COO-H+RSO3-H3+NR1COOH

RSO3-H++H3N+R1COOHRSO3-Na++H3+NR1COO-RSO3-H3+NR1COO-Na+氢型磺酸树脂吸附丙氨酸:酸洗脱丙氨酸:钠型磺酸树脂吸附丙氨酸:2930离子交换操作方法树脂预处理离子交换吸附洗脱31树脂预处理物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒；化学处理：转型（氢型或钠型）阳离子树脂酸—碱—酸阴离子树脂碱—酸—碱最后以去离子水或缓冲液平衡32离子交换纤维素的处理和再生处理时间:从4h缩短为0.3-1h,浸泡用的酸碱浓度要适当降低,使用前须用大量水浸泡，充分溶涨。然后用数十倍的(如50倍)0.5mol/L盐酸和0.5mol/L氢氧化钠溶液反复浸泡处理，每次换液皆须用水洗至近中性,第二步处理时按交换的需要决定平衡离子。最后以交换用缓冲液平衡备用，碱处理时，阳离子交换纤维素膨胀很大，影响过滤或流速，解决方法：0.5mol/LNaOH+0.5mol/LNaCl.33离交操作方式静态：操作简单、但是分批操作，交换不完全动态：离子交换柱，操作连续、交换完全，适宜多组份分离

34洗脱方式（1）改变溶液pH值（2）改变溶液离子强度35树脂再生酸性阳离子树脂酸-碱-酸-缓冲溶液淋洗碱性阴离子树脂碱-酸-碱-缓冲溶液淋洗36离子交换分离法的应用水的净化H+OH-阳离子交换阴离子交换R-SO3H+M+R-SO3M+H+RN+H3OH-+X-RN+H3X-+OH-H++OH-H2O除去水中的杂质离子去离子水3738离子交换应用离子交换法提取蛋白质较无机离子的离子交换平衡复杂，其吸附行为与离子间的静电引力、氢键、疏水作用以及范德华力有关蛋白质是生物大分子物质，其扩散行为也较无机离子复杂39SomeofthechargedregionswhichwillinfluenceionexchangeDifferentproteinshavedifferentchargesanddifferentpatternsofsurfacechargeBasisforselectivity40NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-LowpHPositivechargeHighpHNegativechargeHydrogengainedHydrogenlostEffectofpHoncharge41-+OverallchargeonproteinNH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-acidisoelectricpoint alkalineexcesspositivechargebalancedpositiveandnegativechargeexcessnegativechargepH310Titrationcurves42离子交换法分离氨基酸

离子交换法是利用各种氨基酸等电点的差异，只有当混合氨基酸之间的等电点相差较大时才能较好地分开。离子交换树脂研究较为成熟，提取氨基酸处理量大，成本低，操作条件容易控制。离子交换法在工业应用中已经有很多成功的实例，如谷氨酸,苯丙氨酸,精氨酸等的分离提取。43TypicalionexchangeproteinseparationLoadingstartsLoadingends,LowsaltwashbeginsProteinabsorbancePeakofunboundproteinSaltgradient01MSaltgradientbeginsSaltgradientendsElutedpeaksofweaklybound(I),moderatelybound(II)andtightlybound(III)proteinsIIIIII44常用于蛋白质提取分离的离子交换剂要求：良好的亲水性、具有较大的均匀网格结构、粒度越小分辨率越高种类：多糖类离子交换纤维素交联葡聚糖交联琼脂糖

聚乙烯醇类Mono系列AmershamPharmacia45蛋白质离子交换分离的基本步骤平衡上样吸附洗脱再生46++++++-------anionexchangebeadEquilibration47Sampleapplicationandwash-----------++++++----48Elution----------------------------------++++++++++++--49Regeneration-----------------------++++++50SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------51蛋白质层析介质的发展概况层析技术的核心是层析介质,选择合适的层析介质、应用合理的工艺条件已成为蛋白质层析技术的关键。52最初主要是天然高分子物质,都为多糖如纤维素、葡聚糖和非交联的琼脂糖凝胶,特点是亲水性好、生物相容性高,缺点是质地较软、不耐压、流速慢,一般称之为软胶(softgel)。随着对蛋白质分离要求的不断提高,新型的层析介质被不断地开发出来,53新型的层析介质

粒度均匀的珠状交联多糖。在保证了经典多糖介质良好的吸附性能的基础上进行交联,不但增加了强度,而且较窄的粒径分布提高了分离效率。如交联琼脂糖凝胶,商品化的有AmershamBiosciences生产的SepharoseFastFlow、SepharoseHighPerformance等系列。54

人工合成的大孔聚合物。基于这类填料的层析被称为灌注层析.其特点是在介质中除了有小的扩散孔,还有大的穿透孔,从而大大加快传质,增加流速。最早商业化的产品是PerSeptiveBiosystems公司1989年推出的Poros系列,目前还有Ciphergen公司的HyperD系列。55触角型(tentacle)吸附剂。这类介质通过增长间隔臂和有效官能团来增加活性配基与蛋白质的相互作用,从而提高效率,如Merck公司的FractogelEMD系列。56软胶包裹在硬胶表面(softgelinarigidshell)。特点是结合了软胶(如琼脂糖)良好的吸附性能和无机材料(如硅胶)的刚性优点,如Ciphergen公司的Spherodex系列。57离子交换层析介质

纤维素离子交换剂,纤维素高度的亲水性能与蛋白质有很好的相容性,缺点:容量低、流速慢。珠状交联葡聚糖、琼脂糖、交联纤维素,是目前得到广泛应用的离子交换介质。人工合成的刚性材料被陆续开发。58活性基团活性基团的pK值决定了相应的离子交换剂的pH工作范围。通常通过酸碱滴定曲线来确定,对同类型的离子交换剂来说,强阳(阴)离子交换剂比弱阳(阴)离子交换剂有更宽的工作范围,是强弱介质的一个重要区别。59活性基团密度对蛋白质吸附能力也有影响。研究了阳离子交换介质活性基团密度的增加(10～500μmol/g)对溶菌酶和细胞色素C的吸附容量的影响,结果表明,在配基密度达到一个极限值之前,蛋白质的吸附容量随着配基密度的增加而明显增加;过了极限值,基本上没有影响。60活性基团种类对蛋白质吸附能力也有影响。一般对同类型的离子交换剂来说,强阳(阴)离子交换剂比弱阳(阴)离子交换剂对蛋白质的结合能力强,需较强的盐浓度进行洗脱。61对于在高盐浓度不稳定或难溶解在高盐浓度的蛋白质进行离子交换层析时,可以使用结合力相对较弱的弱离子交换剂。62基质及其对分离性能的影响基质对蛋白质分离效果影响较大的是其表面性质,如亲水性和内部的孔径分布。目前,用于蛋白质分离的离子交换介质一般都有较好的亲水性能,内部的孔径分布对蛋白质的分离影响更大,不但决定了蛋白质分离的范围,而且还决定了蛋白质扩散的速度。63和凝胶过滤介质相比,离子交换对孔径没有特定的要求,一般选择较大孔径以利于蛋白质分子的扩散从而加快平衡、提高容量。基质的性质还决定了介质的溶胀性能、耐压性能等。64离子交换介质性能表征离子交换介质性能的参数很多,可以分为物理性能、化学性能和色谱性能三大类。物理性能有粒径、孔径、压降、溶胀性、流速、扩散等,化学性能主要指交换量、介质的化学稳定性等色谱性能主要有容量、分辨率、塔板高度、保留值等。65“三相纯化策略”

富集(capturestep)

对目标蛋白质进行初步纯化,去除那些与目标蛋白质性质差异很大的物质,如细胞的DNA、RNA等;尤其是去除那些对目标蛋白质不稳定的物质如各种蛋白酶。通常应用的层析技术有离子交换、疏水作用、亲和层析,对层析介质的要求是流速快、载量大。66

中间纯化(intermediatestep)

进一步纯化目标蛋白,去除那些在分子大小、理化性质与目标蛋白质类似的杂质,通常采用与富集时不同的层析技术,对分离介质的要求是选择性好(分辨率高)、载量大,通常应用颗粒较小的介质。67精制(polishingstep)最终去除那些痕量杂质,达到产品的纯度要求,凝胶过滤是这一步中经常使用的层析技术,对分离介质的要求集中在高选择性上。68蛋白质层析介质存在问题目前通用型介质大都采用琼脂糖这类软基质,填料的耐压性较差,易变形而破碎,而且不耐酸,使用寿命无法和聚合物类型的介质相比。69动力学性能远不如膜分离技术,尤其在大分子蛋白质分离过程中。传统层析介质由于其内扩散的速度相对膜分离缓慢，因此介质内的功能基团无法被充分利用,工作交换(吸附)容量有限由于蛋白质大分子的扩散慢,层析时间较长和洗脱液体积较大,影响效率。70越来越多的人工合成或复合型的刚性材料被开发出来,提供了高流速、高选择、高载量及可操作性的介质,是未来蛋白质层析介质发展的趋势。71对策用低价、生物相容性好的基质材料制备层析介质。多糖类的天然高分子材料可以作为介质的基质,如纤维素、壳聚糖。由于价廉和生物相容性好的两大优点可以取代琼脂糖成为蛋白质分离的理想填料。也可将它们和其它聚合物涂层或混融制备填料基质。72良好的致孔技术

研制多种类的致孔剂介质的动力学性能取决于内部的孔结构,只有拥有均匀的、大小合适的孔径分布才能有好的动力学性能,才能最大限度发挥填料的交换(吸附)作用和选择性能。73开发大颗粒的耐压性能好的全合成聚合物颗粒的增大提高了流速,给大规模生产操作带来极大的便利,相应的设备投资可以大大降低,在具备良好的孔结构的基础上还要保证介质具有耐压的性能。74离子交换树脂在食品工业中的应用

树脂用于制糖工业已有30多年的历史。蔗糖、甜菜糖、葡萄糖等在制造中都需要脱除色素。糖液中的色素种类很多，其中多以有机阴离子或两性离子存在，用大孔氯型强碱阴离子树脂可有效