微生物次级代谢与调节一

4微生物次级代谢与调节次级代谢产物(Secondarymetabolites)是某些微生物在生命循环的某一个阶段产生的物质，它们一般是在产生菌生长中止后合成的。微生物产生的次级代谢物有抗生素、毒素、色素和生物碱等。2/4/20231现代工业发酵调控学郭晓燕4.1.1微生物次级代谢的特征

次级代谢产物一般不在产生菌的生长期产生，而在随后的生产期形成。种类繁多，含有不寻常的化学键，如氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、麦角生物碱、吲哚衍生物、吩嗪、吡咯、喹啉、萜烯、四环类抗生素等。一种菌可以产生结构相近的一簇抗生素。例如，产黄青霉能产生至少10个具有不同特性的青霉素。2/4/20232现代工业发酵调控学郭晓燕2/4/20233现代工业发酵调控学郭晓燕微生物次级代谢的特征一簇抗生素中各组分的多少取决于遗传与环境因素。次级代谢物合成所涉及的酶的特异性较低；而初级代谢方面的特异性总是很高，因差错会导致致命性的后果。次级代谢方面的差错对细胞的生长无关紧要，改变后的代谢产物有些还保留生物活性。2/4/20234现代工业发酵调控学郭晓燕微生物次级代谢的特征有人认为，次级代谢产物之所以种类繁多，就是因为酶的底物特异性不高所致。他们把次级代谢过程又称为多向代谢作用(pleometabolism)。2/4/20235现代工业发酵调控学郭晓燕微生物次级代谢的特征

一种微生物的不同菌株可以产生多种在分子结构上完全不同的次级代谢产物，例如，灰色链霉菌不仅可以用于生产链霉素，还可用来生产白霉素、吲哚霉素、灰霉素、灰绿霉素等。不同种类的微生物也能产生同一种次级代谢产物。次级代谢产物的合成对环境因素特别敏感。其合成信息的表达受环境因素调节。如对抗生素的合成需在较低的磷酸盐浓度0.1~10mM范围内进行，而生长能耐受的范围平均要大10倍，即0.3~300mM。2/4/20236现代工业发酵调控学郭晓燕微生物次级代谢的特征微生物由生长期向生产期过渡时，菌体在形态学上会发生一些变化。例如，一些产芽胞的细菌在此时会形成芽胞，真菌和放线菌会形成孢子。因此，有人把次级代谢产物的合成作用看作是细胞分化的伴随现象。微生物的次级代谢产物的合成过程是一类由多基因控制的代谢过程。这些基因不仅位于微生物的染色体中，且位于质粒中，并且染色体外的基因在次级代谢产物的合成中往往起主导作用。2/4/20237现代工业发酵调控学郭晓燕吖啶黄插入质粒DNA双链碱基对之间，造成碱基对增加或减少，高温则使质粒变性。它们使原来产生抗生素的质粒不能复制，从而影响抗生素的产生，说明了质粒控制着抗生素的合成。从春日霉素和金丝霉素产生菌春日链霉菌的体内分离出质粒，经电镜观察有三种不同长度（15μm、3.4μm和0.59μm）的DNA。含有15μmDNA的质粒控制春日霉素的合成；含有3.4μmDNA的质粒，控制金丝霉素合成。2/4/20238现代工业发酵调控学郭晓燕4.1.2次级代谢产物的类型

可根据次级代谢产物分子中的主要组分与初级代谢的关系，把次级代谢产物分成五个基本类型糖类许多次级代谢产物在结构上明显与糖类物质有关。它们的前体物质都是葡萄糖，但是它们的结构在次级代谢过程中被修饰了。例如，链霉素，新霉素和卡那霉素等均是分子结构被修饰了的寡糖类抗生素。2/4/20239现代工业发酵调控学郭晓燕链霉素是由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-氨基葡萄糖胺三部分组成。2/4/202310现代工业发酵调控学郭晓燕次级代谢产物的类型多肽类同糖类物质一样，氨基酸或其聚合物(多肽)在次级代谢过程中常常被修饰，形成多肽类抗生素。例如链霉菌产生的放线菌素是由寡肽构成的。还包括芳香族氨基酸或其他氨基酸合成途径的中间体产物被修饰后形成的抗生素。例如，委内瑞拉链霉菌产生的氯霉素和头状链霉菌产生的丝裂霉素C等。2/4/202311现代工业发酵调控学郭晓燕次级代谢产物的类型聚脂酰类这类化合物均以活性脂酰作为前体，通过聚合作用形成的。由乙酰辅酶A可以形成两类自身缩合产物：一类是通过头尾联接的聚乙酮(酰)化合物；另一类是通过新形成的活性异戊二烯的寡聚作用形成的化合物。这类化合物可形成萜类、甾类和类胡萝卜素类次级代谢产物。属于这类次级产物的有水稻恶苗病菌产生的赤霉素等。2/4/202312现代工业发酵调控学郭晓燕次级代谢产物的类型核酸碱基类似物类此类次级代谢产物的合成明显地与核酸碱基的合成相关。它们或者由细胞中现成的核苷酸经化学修饰转变而来，或者通过与核苷酸生物合成相似的过程合成而来。例如6-氨基嘌呤，焦土霉素，狭霉素，蛹螬菌素等。2/4/202313现代工业发酵调控学郭晓燕次级代谢产物的类型其它类型微生物还产生一些不属于上述四种类型的次级代谢产物。因为人们很难根据这类化合物分子中的组分的来源，把它们归于上述任何一种类型的次级代谢产物。2/4/202314现代工业发酵调控学郭晓燕4.1.3抗生素的生源学(Biogenesis)

生源学又称为生物发生学，是指一些天然物质，包括有生命的物质为什么会发生，存在的学问，它对宿主，环境有何作用？抗生素生源学研究一些微生物为什么会产生这类对其它微生物，甚至对其自身有害的物质,其功能是什么？在这方面的了解将有助于解释抗生素的形成机制和控制其生产。2/4/202315现代工业发酵调控学郭晓燕抗生素的生源学(Biogenesis)

1)合成次级代谢物是作为储藏物。2)作为正常代谢的无用的副产物。3)大分子消化后残留的碎片。4)解除体内有害代谢物的毒性。5)支路代谢物。6)竞争需要用于抑制其它微生物，争夺有限的养分。2/4/202316现代工业发酵调控学郭晓燕抗生素的生源学(Biogenesis)7)进化遗留所致。8)在自然界具有生态上功能。9)调节功能，至少与形态学，分化方面有关。10)代谢维持产物，其作用主要是代谢过程而不是产物本身。2/4/202317现代工业发酵调控学郭晓燕4.1.4初级与次级代谢途径相互连接次级代谢物的生物合成包含：养分吸收入细胞内通过中枢代谢途径养分转化为中间体小分子的生物合成（次级代谢物的前体）如有必要，改变其中一些中间体这些前体进入次级代谢物生物合成的特有的途径在次级代谢物的主要骨架形成后，最后转化为产物2/4/202318现代工业发酵调控学郭晓燕生长与次级代谢产物共用的代谢中间产物

2/4/202319现代工业发酵调控学郭晓燕2/4/202320现代工业发酵调控学郭晓燕2/4/202321现代工业发酵调控学郭晓燕有三种用于将初级代谢中间体修饰为次级代谢终产物的生化过程生物氧化与还原生物甲基化生物卤化2/4/202322现代工业发酵调控学郭晓燕4.2次级代谢物生物合成的前体

次级代谢物的生物合成过程除了在前体的形成和聚合过程方面外皆遵循一般的生物合成规律。次级代谢途径同初级代谢的分解代谢、无定向代谢和组成代谢紧密相关。其前体通常是正常的或经修饰的初级代谢的中间体。2/4/202323现代工业发酵调控学郭晓燕次级代谢物生物合成的前体

按Rose(1979)的定义，前体(precursor)是在细胞内生成的，或由培养基提供的，能被代谢形成某种终产物的物质。Stanbury等(1984)把前体定义为，加入到某一培养基中的一些化学物质被直接结合到所需产物中。

2/4/202324现代工业发酵调控学郭晓燕前体与中间体前体是指加入到发酵培养基中的某些化合物能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。中间体是指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。2/4/202325现代工业发酵调控学郭晓燕表4-4可作为次级代谢物的前体的一些中间体2/4/202326现代工业发酵调控学郭晓燕(1)短链脂肪酸含聚酮化物(polyketide)中间体的一些次级代谢物是由乙酸、丙酸、丁酸和其它短链脂肪酸形成的。乙酸、丙酸以乙酰CoA和丙酰CoA的形式，分别作为C2和C3起始单位，而正常的延伸单位为丙二(酸单)酰-CoA和甲基丙二酰-CoA,它们分别为C2和C3的延伸单位。2/4/202327现代工业发酵调控学郭晓燕单体的形成乙酰CoA+ATP+CO2+H2O丙二酰CoA+ADP+Pi丙酰CoA+ATP+CO2+H2O甲基丙二酰-CoA+ADP+Pi丙酰CoA+草酰乙酸甲基丙二酰-CoA+丙酮酸2/4/202328现代工业发酵调控学郭晓燕单体的形成丙二酰-CoA是由乙酰-CoA羧化酶催化乙酰CoA形成的。甲基丙二酰-CoA可通过丙酰CoA羧化酶或甲基丙二酰-CoA羧基转移酶催化，由丙酰CoA形成。2/4/202329现代工业发酵调控学郭晓燕短链脂肪酸为前体的抗生素红霉素引物：丙酰CoA单体：2-甲基丙二酰CoA四环素引物：丙二酰胺CoA单体：丙二酰CoA2/4/202330现代工业发酵调控学郭晓燕2/4/202331现代工业发酵调控学郭晓燕（2）异戊二烯单位2/4/202332现代工业发酵调控学郭晓燕（3）经修饰的氨基酸D-氨基酸甲基氨基酸氨基酸生物合成途径的中间体2/4/202333现代工业发酵调控学郭晓燕（4）芳香中间体有许多抗生素的芳香部分是由莽草酸途径的中间体或终产物形成的。2/4/202334现代工业发酵调控学郭晓燕由芳香中间体合成的抗生素和其它次级代谢物2/4/202335现代工业发酵调控学郭晓燕（5）经修饰的糖与氨基糖2/4/202336现代工业发酵调控学郭晓燕（6）环己醇与氨基环己醇2/4/202337现代工业发酵调控学郭晓燕2/4/202338现代工业发酵调控学郭晓燕（7）脒基和甲基脒基的供体一般是精氨酸甲基的供体是甲硫氨酸2/4/202339现代工业发酵调控学郭晓燕（8）经修饰的嘌呤或嘧啶碱2/4/202340现代工业发酵调控学郭晓燕4.2.2前体的作用起抗生素建筑材料的作用诱导抗生素生物合成的作用2/4/202341现代工业发酵调控学郭晓燕前体与诱导物的区别诱导作用在次级代谢物的合成控制上起重要作用。有时难于区分这种促进作用是真的诱导作用还是起前体作用。2/4/202342现代工业发酵调控学郭晓燕前体与诱导物的区别

一般，可把那些能在生长期内促进抗生素生物合成的化合物看作诱导物，而前体往往只在生产期内起作用，甚至蛋白质合成受阻的情况下也行。诱导物应能被非前体的结构类似物取代。2/4/202343现代工业发酵调控学郭晓燕前体与诱导物的区别

如甲硫氨酸除了可作为头孢菌素合成的前体，提供S的作用，更为重要的作用在于诱导节孢子的形成，而后者的多寡影响头孢菌素的合成。甲硫氨酸可被亮氨酸取代。2/4/202344现代工业发酵调控学郭晓燕前体与诱导物的区别

诱导物的另一个特征是其诱导系数特别高，如给链霉素生物合成受阻的突变株1g纯的A因子(在接种时)，可诱导1g链霉素的形成，其诱导系数为106。2/4/202345现代工业发酵调控学郭晓燕4.2.3前体的限制性

前体常常是次级代谢物生物合成的限制因素。如在发酵过程中加入苯乙酸可强烈地促进苄青霉素的生产；丙酸或丙醇促进大环内酯抗生素的生物合成。肽类抗生素的形成中非蛋白的氨基酸成分通常是限制因素。如粘菌素的生物合成受-氨基丁酸和,-二氨基丁酸的限制；杆菌肽的生产受鸟氨酸的限制。2/4/202346现代工业发酵调控学郭晓燕前体的限制性

乙酰CoA的缺少会限制四环素的生产。金黄色链霉菌的低产菌株的特征是乙酰CoA倾向于走三羧酸循环而被氧化；高产菌株没有这一倾向。

Streptomycesnourseivarpolifungini合成制霉菌素的能力的提高与其前体，丙二酸和甲基丙二酸合成的增加有关。2/4/202347现代工业发酵调控学郭晓燕4.2.3.1前体合成的调节机制当初级代谢和次级代谢均需要同一种必需的前体时，则低浓度前体需先满足生长的需要。如某一前体是次级代谢生物合成的限制因素，则除去控制前体生物合成的反馈调节机制可使抗生素增产。2/4/202348现代工业发酵调控学郭晓燕4.2.3.1前体导向抗生素的合成次级代谢物合成途径第一个酶往往是关键。途径中还可能存在另一些限制性酶。这些酶往往受到反馈、碳、氮、或磷的调节。另一些酶受到高浓度前体的诱导。2/4/202349现代工业发酵调控学郭晓燕前体的限制性前体物质可能不能被细胞吸收。不能被运送到次级代谢产物合成的部位。添加的物质不是次级代谢产物合成过程起限定作用的物质。2/4/202350现代工业发酵调控学郭晓燕添加前体的策略

外源前体在发酵液中的残留浓度过高，会使生产菌中毒，不利于抗生素的合成。但前体不足也不行。因此，研究适当的前体添加策略对有些抗生素的高产稳产有重要意义。2/4/202351现代工业发酵调控学郭晓燕添加前体的策略可在基础料中添加过程添加前体时宜少量多次或流加，控制发酵液中前体残留浓度在适当范围。2/4/202352现代工业发酵调控学郭晓燕4.3次级代谢物的生物合成

一旦前体被合成，它们便流向次级代谢物生物合成的专用途径。在某些情况下单体结构单位被聚合，形成聚合物，如聚酮化物，寡肽和聚醚类抗生素等。这些特有的生物合成中间产物需作后几步的结构修饰。修饰的深度取决于产生菌的生理条件。最后，有些复杂抗生素是由几个来自不同生物合成途径组成的。2/4/202353现代工业发酵调控学郭晓燕次级代谢物的生物合成

4.3.1.把前体引入次级代谢物生物合成的专用途径。了解这方面所涉及的生物合成酶的知识很重要。这种专用途径的第一个酶特别重要，因它决定了前体进入次级代谢物合成途径的通量，中间体的流向和途径的生产能力。2/4/202354现代工业发酵调控学郭晓燕4.3.2前体聚合作用过程2/4/202355现代工业发酵调控学郭晓燕4.3.3次级代谢物结构的后几步修饰

2/4/202356现代工业发酵调控学郭晓燕4.3.4复合抗生素中不同部分的装配

2/4/202357现代工业发酵调控学郭晓燕复合抗生素中不同部分的装配

2/4/202358现代工业发酵调控学郭晓燕4.3.5次级代谢物合成酶的专一性

次级代谢物合成酶往往只具有簇的专一性，即对基质分子的某一部分有要求，对分子的其它部分无绝对要求。乙酰CoA、丙二酰CoA和丙二酰胺CoA可在四环类抗生素形成中起引物的作用，这是由于缺少高度专一性所致。2/4/202359现代工业发酵调控学郭晓燕不是所有次级代谢物合成酶都缺乏基质专一性，有些具有高度专一些。2/4/202360现代工业发酵调控学郭晓燕4.5微生物次级代谢作用的调控4.5.1次级代谢与生长分化的关系P203（1）细菌（2）放线菌A因子P200（3）真菌2/4/202361现代工业发酵调控学郭晓燕初级代谢物可诱导合成酶的产生从而增加最终产物的产量。在放线菌发酵过程起诱导作用的是内源代谢物如A因子。A因子既可诱导灰色链霉菌和比基尼链霉菌（Streptomycsbikiniensis）的形态分化，又诱导其化学分化．并且促进气生菌丝、分生孢子、链霉素合成酶以及链霉素的形成。在灰色链霉菌中，A因子能在转录水平上诱导至少10种蛋白质，其中之一是链霉素-6-磷酸转移酶，这种酶具有两种功能：其一是参与链霉素的生物合成；其二是与抗性有关。2/4/202362现代工业发酵调控学郭晓燕4.5.2次级代谢过程的启动的原因可能是生长期末细胞的酶的组成发生变化，与次级代谢物合成有关的酶的突然出现有关；也可能是前体的积累，起诱导物的作用或编码次级代谢产物的基因从分解代谢物阻遏中解除阻遏所致。2/4/202363现代工业发酵调控学郭晓燕参与初级代谢的酶是通过诱导产生的比生长速率（）下降也是一种诱导因素2/4/202364现代工业发酵调控学郭晓燕4.5.2.2启动抗生素的几种调控机制

尽管抗生素具有非常重要的社会和经济重要性，但并不存在一个能够解释它们生理调节的通用的控制模型。2/4/202365现代工业发酵调控学郭晓燕启动抗生素的几种调控机制

此类调节往往发生在转录水平，具体证据为：直到生长速率下降时，才出现编码抗生素合成的mRNA。2/4/202366现代工业发酵调控学郭晓燕次级代谢物启动的假想机制图4-37比生长速率（）下降限制性养分的耗竭几种调节因子的联合作用（cAMP,碳源，氮源，或磷源的同化速率)严谨响应(strigentresponse)微生物信号因子2/4/202367现代工业发酵调控学郭晓燕(1)碳源分解代谢物对抗生素生物合成的影响（2）N源分解代谢物的调节（3）磷酸盐的调节作用2/4/202368现代工业发酵调控学郭晓燕

丙二酰CoA合成途径

2/4/202369现代工业发酵调控学郭晓燕抗生素生物合成的终止2/4/202370现代工业发酵调控学郭晓燕抗生素生物合成的终止抗生素合成的中止不是由于产生菌细胞失去活力，而是有三种可能的原因使抗生素生物合成终止：1)抗生素生物合成途径的一个或更多的酶的不可逆的衰退；2)积累的抗生素产生的反馈抑制作用；3)抗生素前体的耗竭。实验证据支持前两种可能性。2/4/202371现代工业发酵调控学郭晓燕定向抗生素生物合成定向抗生素生物合成有多种可行的办法。用于制备新的和分子结构发生变化的抗生素的主要方法有：1)抗生素产生菌的突变作用；2)简单使用非天然前体；3)在生物合成的各步骤中使用抑制剂或诱导物；4)用生物合成途径的某一或多步骤受阻的阻断型突变株，或加入非天然的前体进行诱变合成或突变生物合成；2/4/202372现代工业发酵调控学郭晓燕定向抗生素生物合成5)在生物合成中用独特的基质和培养基；6)利用嗜高渗等嗜极端环境条件的微生物作为抗生素生产菌株，也可以考虑采用厌氧微生物或发酵周期很长的微生物进行生产；2/4/202373现代工业发酵调控学郭晓燕定向抗生素生物合成7)通过另一种微生物产生的酶或分离出的酶改造代谢产物；8)混合培养发酵有时能提供结构更复杂的代谢产物；9)基因操纵。2/4/202374现代工业发酵调控学郭晓燕抗生素生物合成的研究方法与次级代谢产物的多样性不同，微生物生物合成次级代谢产物的生化反应可以归纳为数目有限的若干条生物合成途径。论证生物合成途径的一般步骤为：①确定构成目的产物的构建单位即生源；②确定生物合成途径中的关键的中间产物，合理地推断反应顺序；③分离鉴别生物合成反应中的关键酶。由于生物合成过程中初级代谢和次级代谢两种途径相互交叉，影响因素很多，因此生物合成机理的研究较为困难。常用的研究方法有