第一节沙门氏菌检验

第一节沙门氏菌检验沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各国的各类细菌性食物中毒中,沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。在英国,以沙门氏菌占首位。美国则为第2位,仅次于金色葡萄球菌。日本则以副溶血弧菌和金色葡萄球菌为最多,沙门氏菌占第3位。我国内陆地区也是以沙门氏菌为首位。世界上最大的一起沙门氏菌食物中毒是1953年于瑞典由吃猪肉而引起的鼠伤寒沙门氏菌中毒,7717人中毒,90人死亡。沙门氏菌属于肠杆菌科,至今已有2230种以上的血清型。概况沙门氏菌引起人的伤寒、副伤寒、感染性腹泻、食物中毒和医院内感染，并引起动物的沙门氏菌病，是重要的肠道致病菌。该菌属在医学、兽医和公共卫生上均十分重要：沙门氏菌的分类根据新近的沙门氏菌的分类方案，本属菌现可分为两个种：肠道沙门氏菌（S.enterica）邦戈尔沙门氏菌（S.bongori）肠道沙门氏菌又分为6个亚种：肠道亚种（enterica）萨拉姆亚种（salamae）亚利桑那亚种（arizonae）双相亚利桑那沙门氏菌（diarizonae）豪顿沙门氏菌（houtenae）因迪卡沙门氏菌（indica）抗原结构菌体(O)抗原─分群鞭毛(H)抗原─分型毒力(Vi)抗原─微荚膜成分O抗原是细胞壁表面的耐热多糖抗原；根据O抗原（群因子）将沙门氏菌分为A、B、C1-C4、D1-D3、E1-E4、F、G1-G2、H……Z和O51-O63以及O65-O67计51个O群，包括58种O抗原。1、O抗原H抗原是本属菌的蛋白质性鞭毛抗原，计有63种；第一相（特异相）：小写英文字母，特异性高第二相（非特异相）：阿拉伯数字，少数用英文字母，特异性低同一O群的沙门氏菌又根据它们的H抗原的不同再细分成许多不同的血清型。2、H抗原Vi抗原是微荚膜成分；相当于K抗原，与毒力（virulence）有关，故称为Vi抗原。新分离的菌株多有Vi抗原，在普通培养基上多次传代后易丢失此抗原，这种变异称为“V-W变异”。3、Vi抗原伤寒沙门氏菌丙型副伤寒沙门氏菌部分都柏林沙门氏菌须鉴定Vi抗原4、血清型以O:H:Vi形式表示：用已知的沙门氏菌O和H单因子血清作玻板凝集试验便可确定一个沙门氏菌分离物的血清型或抗原式，对可能有Vi抗原的菌株还须用Vi抗血清鉴定之。举例：1,4,[5],12:i:1,29,12,Vi:d:–目前本菌属至少已有2500个血清型。对人和温血动物致病的血清型绝大多数分属于AF群，在疾病中经常出现的不足50种。常用检验用培养基DHL琼脂成分蛋白胨20g牛肉膏3g乳糖

10g蔗糖

10g去氧胆酸钠1g硫代硫酸钠2.3g柠檬酸钠1g柠檬酸铁铵

1g中性红0.03g琼脂1820g蒸馏水1000mlpH7.3制法：将除中性红和琼脂以外的成分溶解于400ml蒸馏水中，校正pH，再将琼脂于600ml蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，并加入0.5%的中性红水溶液6ml，待冷至55℃，倾注平板。

sal.为无色半透明菌落，产H2S者为黑色菌落。SS琼脂(沙门氏-志贺氏琼脂)基础培养基牛肉膏5g蛋白胨5g三号胆盐3.5g琼脂17g蒸馏水1000ml121℃,15min高压灭菌完全培养基基础培养基1000ml乳糖

10g柠檬酸钠8.5g硫代硫酸钠8.5g10%柠檬酸铁溶液10ml1%中性红溶液

2.5ml0.1%煌绿溶液

0.33ml加热溶化基础培养基,按比例加入上述除染料以外之各成分,充分混合均匀,矫正至pH7.0,加入中性红和煌绿溶液,倾注平板.注1:制好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱内于48h内使用注2:煌绿溶液配好后应在10天以内使用注3:可以购用SS琼脂的干燥培养基

sal.为无色半透明菌落，产H2S者为中心带黑色，乳糖阳性者为粉红色，中心带黑色。亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）成分蛋白胨5g乳糖4g亚硒酸氢钠

4g磷酸氢二钠5.5g磷酸二氢钾4.5gL-胱氨酸

0.01g蒸馏水1000ml1%L-胱氨酸–氢氧化钠溶液的配制：称取L-胱氨酸0.1g，加1mol/L氢氧化钠1.5ml，使溶解，再加入蒸馏水8.5ml即成。制法将除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸以外的各成分溶解于900ml蒸馏水中，加热煮沸，待冷备用。另将亚硒酸氢钠溶解于100ml蒸馏水中，加热煮沸，待冷，以无菌操作与上液混合。再加入1%L-胱氨酸-氢氧化钠1ml。分装于灭菌瓶中，每瓶100ml，pH应为7.1氯化镁孔雀绿增菌液（MM）甲液胰蛋白胨5g氯化钠8g磷酸二氢钾1.6g蒸馏水1000ml乙液氯化镁40g蒸馏水100ml丙液0.4%孔雀绿水溶液制法分别按上述成分配好后，121℃，15min灭菌备用。临用前取甲液90ml、乙液9ml、丙液0.9ml，以无菌操作混合即可。四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）基础培养基蛋白胨5g胆盐

1g碳酸钙10g硫代硫酸钠30g蒸馏水1000ml碘溶液碘6g碘化钾5g蒸馏水20ml制法将基础培养基的各成分加入蒸馏水中，加热溶解，分装每瓶100ml。分装时应随时振摇，使其中的碳酸钙混匀。121℃，15min，灭菌。临用时每100ml基础培养基中加入碘溶液2ml、0.1%煌绿溶液1ml。亚硫酸铋琼脂（BS）成分蛋白胨10g牛肉膏5g葡萄糖5g硫酸亚铁0.3g磷酸氢二钠4g煌绿0.025g柠檬酸铋铵

2g亚硫酸钠

6g琼脂1820g蒸馏水1000mlpH7.5制法将前五种成分溶解于300ml蒸馏水中将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠另用50ml蒸馏水溶解将琼脂于600ml蒸馏水中煮沸溶解，冷至80℃。将以上三液合并，补充蒸馏水至1000ml，矫正pH，加0.5%煌绿水溶液5ml，摇匀，冷至55℃时，倾注平板注：此培养基不需高压灭菌。制备过程中不宜过分加热，以免降低其选择性。应在临用前一天制备，贮存于室温暗处。超过48h不宜使用。产H2S者为黑色有金属光泽，不产H2S者为灰绿色的菌落。尿素琼脂成分蛋白胨1g氯化钠5g葡萄糖5g磷酸二氢钾2g0.4%酚红溶液3ml琼脂20g蒸馏水1000ml20%尿素溶液100mlpH7.2制法将除尿素以外的成分配好，并高压灭菌后，冷至55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%，最终pH为7.2，分装于灭菌试管内，放成斜面备用。试验方法挑取琼脂培养物接种，在37℃，培养24h，观察结果，尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。氨基酸脱羧酶试验培养基成分蛋白胨5g酵母浸膏3g葡萄糖1g蒸馏水1000ml1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1mlL-氨基酸或DL-氨基酸0.5g或1g/100mlpH6.8制法将除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100ml，加入各种氨基酸、赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于37℃，培养18-24h。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。ONPG培养基成分邻硝基酚--D-半乳糖苷（ONPG）60mg0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）10ml1%蛋白胨水（pH7.5）30ml制法将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于试管内，每管0.5ml。用橡皮塞塞紧。试验方法将细菌接种于37℃培养1-3h和24h观察结果。如果-半乳糖苷酶产生，则于1-3h变黄色，如无此酶则24h不变色。氢化钾（KCN）培养基成分蛋白胨10g氯化钠5g磷酸二氢钾0.225g磷酸氢二钠5.64g蒸馏水1000ml0.5%氢化钾溶液

20mlpH7.6制法将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121℃，15min。每100ml培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0ml。试验方法37℃，培养1-2天。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2天培养不生长为阴性（抑制）。缓冲蛋白胨水（BP）成分蛋白胨10g氯化钠5g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）

9g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000mlpH7.2制法按上述成分配好后，121℃，15min灭菌。临用时无菌分装每瓶225ml。注：本培养基供沙门氏菌前增菌用前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取25g（ml），加在装有225ml缓冲蛋白胨水的500ml

广口瓶内。固体食品可先磨碎或乳化，于37℃培养4h（干蛋品1824h）。移取10ml，转种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养1824h。同时，另取10ml，转种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于37℃培养1824h。为何要用两种不同的增菌液呢？亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）四硫磺酸酸盐增菌液（TTB）+对猪霍乱和羊流产sal有毒性TTB适于伤寒沙门氏菌增菌；MM适于其它各种沙门氏菌；检样前增菌法：冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品25g+BP225ml直接增菌法：鲜肉、鲜乳或其它未经加工的食品25g+灭菌生理盐水25ml，做成检样匀液10ml+MM（或TTB）100ml10ml+SC100ml检样匀液25ml+MM（或TTB）100ml检样匀液25ml+SC100mlBSDHL（或SS、HE、WS）挑取可疑菌落TSI，靛基质试验、尿素（pH7.2）、KCN、赖氨酸H2S+；靛基质-；尿素-；KCN-；赖氨酸+；H2S+；靛基质+；尿素-；KCN-；赖氨酸+；H2S-；靛基质+；尿素-；KCN-；赖氨酸+/-；非如左述的各种反应结果沙门氏菌血清学试验沙门氏菌血清学试验非沙门氏菌非沙门氏菌甘露醇+、山梨醇+ONPG+报告42℃18-24h37℃42℃37℃鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其它未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g（25ml）加入灭菌生理盐水225ml，按前法做成检样匀液；取25ml接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养24h；另取25ml接种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于37℃，培养1824h。分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂（BS）和一个DHL琼脂平板（或SS琼脂平板）。两种增菌液可同时划线接种于同一个平板上。于37℃分别培养1824h或4048h（BS）观察各个平板上生长的菌落特征。选择性琼脂平板沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙门氏菌Ⅲ（即亚利桑那菌）亚硫酸铋琼脂产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落黑色有金属光泽DHL琼脂平板无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与前相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色SS琼脂无色半透明，产硫化氢菌株中心带黑色，但不如以上培养基明显乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与前相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色，但中心无黑色形成时与大肠杆菌不能区别。沙门氏菌属各群在选择性琼脂平板上的菌落特征生化试验自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂上，只有斜面产酸并同时硫化氢（H2S）阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能斜面底层产气硫化氢可能的菌属和种-++/-+沙门氏菌属、费劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌+++/-+沙门氏菌Ⅲ、费劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌-++-沙门氏菌属、大肠杆菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属-+--伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠杆菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属+++/--大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、费劳地氏柠檬酸杆菌注：+阳性；-阴性；+/-多数阳性，少数阴性。肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果在接种三糖铁的同时，再接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾培养基（KCN）和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于37℃培养18-24h，必要时可延长至48h。肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定菌属A1沙门氏菌属A2沙门氏菌属（少见）、缓慢爱德华氏菌B1沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌属血清型分型鉴定抗原的准备O抗原的鉴定用AF多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照，在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。H抗原的鉴定Vi抗原的鉴定须强调的是，虽然对沙门氏菌有各种新的分类方案，但通常仍惯用简单的通用命名，即以该菌所致疾病或最初分离地名、或抗原式三种方式来命名。群别菌型抗原OHA甲型副伤寒沙门氏菌1,2,12a:-B乙型副伤寒沙