本科毕业答辩PPT

学生姓名：胡云杰专业班级：生科1102班指导教师：曹小勇

2015届学士学位论文答辩报告材料与方法摘要

一二引言

结果与分析讨论三四五摘要1★目的

本研究以西洋参成熟种胚为材料，评价麦草畏对体细胞胚胎发生的影响，确定麦草畏在西洋参体细胞胚胎发生中的作用，为西洋参快繁积累相关资料。★方法

以MS培养基为基础培养基，附加(0.05-2)mg/L麦草畏，0.5mg/L2,4-D以及0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L麦草畏组成八组培养基，对西洋参成熟种胚进行离体培养。★结果

材料培养40天后，在MS培养基上未形成愈伤组织及胚状体；在附加不同浓度麦草畏的培养基上，都能诱导出愈伤组织和胚状体，其中1mg/L麦草畏的效果最佳，愈伤率为94.34%，胚状体发生率为56.60%；在添加0.5mg/L2,4-D的培养基上愈伤组织和胚状体发生率均为100%；在添加0.5mg/L麦草畏和0.5mg/L2,4-D的混合培养基上，愈伤组织和胚状体发生率分别为95%,80%。

★结论麦草畏可以诱导西洋参成熟种胚形成愈伤组织和胚状体，其中1mg/L麦草畏的诱导效果最佳，但是效果不及2,4-D，在与2,4-D混合使用时对比2,4-D单独使用的效果，也有所降低。

西洋参（Americanginseng）又名花旗参、美国参，系五加科人参属多年生草本植物，原产于美国和加拿大。它含有多种生理活性物质，如西洋参皂苷、多糖、黄酮类、挥发油、微量元素等，其中属西洋参皂苷的生理活性最为显著。西洋参还具有镇静镇惊、安神促智、抗心律失常、抗休克、保护心肌、防血管硬塞、降血脂、增强机体免疫功能、抗应激、抗肿瘤、保肝的药理作用。我国自1975年10月开始有计划地引种西洋参，目前已形成了四大生态气候栽培区：东北栽培区、华北栽培区、华中栽培区和康滇栽培区。隶属于华中栽培区的陕西汉中地区从1978年引种栽培，获得成功。西洋参生长缓慢,对生长环境要求严格，栽培技术复杂，存在种胚后熟现象，在自然状态下需要长达20-22个月才能打破休眠，常规育种方法很难满足生产上的需求。到目前为止人们在西洋参的组织培养及体细胞胚胎发生方面已经做了较为深入和系统的研究，但至今尚未确立稳定的西洋参快速繁殖体系。如果与常规育种方法相结合，通过离体培养技术，建立体细胞胚胎发生的无性繁殖系，在细胞和组织水平上进行抗病等抗性育种，就可以缩短育种年限，加快育种进程。引言2

材料与方法33.1材料本实验的研究材料为西洋参成熟种胚。于2014年11月初，经留坝县科技局中药办协助，从陕西省汉中市留坝县西洋参种植基地购得。经过沙藏层积处理，大部分种子已经出现裂口。SW-CJ-IF超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、YXQ-IL-50高压蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、SR-1607C型电磁炉（尚明堂电器有限公司）、FA-2004N型电子天平、NikonSM2800体视显微镜、NikonE600显微镜、SONYdsc-h3数码相机、培养架、冷藏冷冻箱等。酒精灯、锥形瓶、容量瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、移液管、胶头滴管、pH试纸、封口膜、广口瓶、镊子、解剖刀、解剖针、培养皿、陶瓷杯、称量瓶、滤纸等。琼脂、蔗糖、2,4-D、麦草畏、有机物、Fe盐、大量元素、微量元素、纯净水、NaOH（1.0mol/L）、HCl（1.0mol/L）、0.1%的升汞溶液、75%的酒精等3.2实验仪器、用具及试剂3.3方法3.3.1种子消毒在沙藏的容器中选取饱满已经裂口的种子，剥去种皮后，取实验材料置于纱网袋用洗涤剂清洗，自来水流水冲洗2个小时。带入超净工作台，75%酒精处理10s，再用0.1%升汞处理8min，进行表面灭菌，然后用无菌水漂洗4次，快速分装到无菌培养皿中。3.3.2培养基本实验以MS培养基为基本培养基,添加3％蔗糖、0.6％琼脂，附加不同种类的植物激素（表1.1），pH值为5.8，在121.0℃、1.1kg/cm2的高温高压下灭菌20min。3.3.3接种将上述准备好的种子切取其种胚，分别接种到八种培养基上，每瓶接种3-4个外植体。置于培养室中培养。3.3.4培养条件温度：25±1℃；光培养：光照强度1000～1500Lux，16h/d。3.3.5观察与记录定期观察，并做好数据统计。7天、10天、20天、40天时，对接种情况进行观察，发现有愈伤组织或胚状体形成时，进行计数并做好记录。3.3.6实验参数的计算方法愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的外植体数∕接种外植体数×100%胚状体发生率=产生胚状体的外植体数∕接种外植体数×100%结果与分析4

接种后7天观察发现各培养基中大部分子叶开始膨大、变绿，胚轴也有所增粗，并且发现培养基中有少量成熟种胚发生污染，其主要原因为灭菌不彻底和接种时细菌污染。10天后观察，发现各培养基中成熟种胚胚轴开始伸长，长出胚芽，并伴有少量褐化现象，但不明显。除了麦草畏浓度0.05mg/L和0.1mg/L的培养基上未发现愈伤外，其他浓度的培养基上均有一定量的种胚在子叶边缘和胚轴基部开始出愈。20天后2,4-D培养基中90%种胚出愈，麦草畏浓度（0.5-2）mg/L培养基中出愈率进一步提高，0.05mg/L和0.1mg/L培养基中仍未发现出愈。40天后观察，愈伤组织上有胚状体形成，且愈伤组织变大，质地变得疏松，胚状体变得明显，每个外植体上的胚状体数量增多。并且有观察到胚状体的两种发生方式：①直接在外植体上发生；②先产生愈伤组织，愈伤组织再分化形成（图f、g）。40天后西洋参成熟种胚愈伤组织和胚状体的形成情况统计表（表2.1）。

表2.140天西洋参成熟种胚的愈伤组织和胚状体发生情况

在未添加任何激素的1号MS空白培养基中，接种7d后，均可见子叶展开，膨大变绿，胚轴有所增粗。40天后，可见子叶卷曲衰老，胚轴胚根均有所伸长，且出现大量褐化现象。随后继续观察，最终未能发现愈伤组织及胚状体出现。(图a)在添加0.5mg/L2,4-D的培养基中，7d后外植体开始萌动，子叶膨大变绿，边缘卷曲，胚轴增粗。10d左右在胚轴基部以及子叶边缘附近产生愈伤组织。培养30天后，整片子叶及胚轴基部都有愈伤组织生成，愈伤组织质地紧密，色泽鲜艳，生长旺盛。同时出现褐化现象，但和1号培养基相比程度较轻。培养40天后，所有外植体均已愈伤化，且愈伤组织大多呈疏松状，部分愈伤组织表面有点状白色突起出现，经显微观察，认为是胚状体的早期形态(图b）。继续培养有胚状体的发生，发生率可达100%。在添加麦草畏的培养基中，接种7d后，均可见到并拢的子叶开始分开，膨大增厚变绿，胚轴增粗。14天后，胚芽萌发，胚轴胚芽开始伸长。20天前后，胚芽进一步伸长，并且出现少量褐化现象，但不明显(图c)。在2mg/L麦草畏的培养基上，在成熟种胚的子叶节及子叶边缘处最先观察到有明显的浅黄色愈伤组织形成，且质地紧密（图d）。40天前后，大部分外植体均已愈伤化。在子叶接触培养基的部位最易观察到愈伤组织，且在子叶的不同部位，还可见一种白色致密膨大突起，这种白色膨大突起可能就是杨振堂等提出的白色致密型的愈伤组织，完整种胚中形成的愈伤组织多为此种致密型愈伤(图e)。继续培养观察，发现部分愈伤组织表面出现肉眼可见的胚状体，有的成簇状，也有的单个存在（图f、g）。总的来看，麦草畏在西洋参成熟种胚愈伤组织和胚状体的发生方面有着与2,4-D相似的效果，不同浓度的麦草畏，最终均能不同程度的诱导出愈伤组织和胚状体。在一定浓度范围内，愈伤率和胚状体发生率随激素浓度的升高而增大，1mg/L时达到最大,愈伤率为94.34%、胚状体发生率56.60%。在此之后随激素浓度的升高而减小。在添加0.5mg/L麦草畏+0.5mg/L2,4—D的混合培养基中，成熟种胚的萌发最快，效果最好。20天后可见，子叶明显膨大变绿且增厚，胚芽明显伸长。而且，愈伤组织和胚状体的发生也是最早的，在20天前后，就可观察到，部分外植体的子叶在接触培养基的部位有少量愈伤组织和早期的胚状体发生。（图h）40天后，大部分外植体均愈伤化，且愈伤明显，胚状体明显，愈伤率为95%、胚状体发生率80%。理论意义和应用价值2参考文献[1]GiustiMM,WrolstadRE.Acylatedanthocyaninsfromediblesourcesandtheirapplicationsinfoodsystem[J].BiochemicalEngineeringjournal,2003,4:217-225.[2]于东,陈桂新,方忠祥.花青苷提取、分离纯化及鉴定的研究进展[J].食品与发酵工业,2009,33(3):127-133.[3]孙建霞,张燕,孙志健等.花青苷的资源分布以及定性定量分析方法研究进展[J].食品科学,2009,30(5):263-268.[4]刘邻渭,食品化学[M].北京:中国农业出版社,1998,116-121.[5]卢其能,杨清.马铃薯花色苷研究进展[J].北方园艺,2007(9):54-57.[6]庞志申.花色苷研究概况[J].北京农业科学,2000,18(5):37-42.[7]JansenG,FlammeW.Colouredpotatoes(SolanumtuberosumL.)-anthccyanincontentandtuberquality[J].GeneticReourcesandCropEvolution,2006,53:1321-1331.[8]BrownCR,WrolstadR,DurstR,eta1,Breedingstudiesinpotatoescontaininghighconcentrationsofanthocyanins.AirierJofPotatoRes,2003,80:241-250.[9]Castaneda-OvandoA,Pacheco-HernandezMD,Paez-HernandezM,etal.Chemicalstudiesofanthocyanins:Areview[J].FoodChemistry,2009,113(4):859-871.[10]王杉,邓泽元,曹树稳.紫薯色素的研究进展[J].粮油食品科技,2004,12(2);45-46.[11][12]房岩强,刘建垒,刘聪等.紫色马铃薯花色苷的提取及性质研究[J]中国粮油学报,2009,24,(8):130-137[13]杨玲,刘利军,蒙春梅.紫罗兰马铃薯花青素的提取及稳定性研究[J].食品研究与开发,2009,30(6):250-256.[14]姜莉,李志华,张正茂等.马铃薯紫色素的提取及稳定性研究[J].食品工技,2009,30(6):265-270.[15]李作平,霍长虹.大孔吸附树脂在水溶性天然药物化学成分提取分离中的应用.河北医科大学学报.2002,23(2):121-123.[16]李伯庭,王湘,李小进.大孔吸附树脂在天然产物分离中的应用[J].中草药,1990,2(8),42-44．[17]OuShiyi,LuoYanlin,XueFeng.Seperationandpurificationofferulicacidinalkaline-hydrolysatefromsugarcanebagassebyactivatedcharcoaladsorption/anionmacroporousresinexchangechromatography[J].FoodEngineering,2006,7(4);1298～1304.[18]朱洪梅,韩永斌,顾振新等.大孔树脂对紫甘薯色素的吸附与解吸特性研究[J].农业工程学报,006,22(5);153-156.[19]BrownCR,WrolstadR,DurstReta1,Breedingstudiesinpotatoescontaininghighconcentrationsofanthocyanins.[J].PotatoRes.80:241-249.[20]HayashiK,MoriM,KnoxYMeta1,Antiinfluenzavirusactivityofared-fleshedpotatoanthocyanin.FoodScienceandTechnologyResearch[J].2003,9(3):242-244.[21]HanKH,HashimotoN,HashimotoMeta1,RedpotatoextractprotectsfromD-galactosamine-inducedliverinjuryinrats.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry[J].2007,70(9):2285-2288.[22]张超,马越,赵晓燕,等.高效液相色谱-质谱法测定紫色马铃薯花色苷组成[J].食品工业科技,2011,33(7):417-422.[23]Rodriguez-SaonaLE,GiustiMM,WrolstadRE.Anthocyaninpigmentcompositionofred-fleshedpotatoes[J].JournalofFoodScience,1998,63(3):458-465[24]FossenT,stedalDO,SlimestadR,etal.AnthocyaninsfromaNorwegianpotatocultivar［J］.FoodChemistry,2003,81:433-437.二、主要研究内容和实验方案主要研究内容1（1）紫色马铃薯花青苷提取工艺研究

①紫色马铃薯花青苷含量的测定；②料液比、乙醇浓度、Ph、提取时间及提取温度的确定；③紫色马铃薯花青苷提取的工艺的优化；（2）紫色马铃薯花青苷纯化工艺研究①最佳大孔树脂比较筛选；②静态吸附和洗脱优化；③动态吸附和洗脱优化；（3）紫色马铃薯花青苷组分定性及定量量研究①样品前处理方法研究；②质谱条件的优化；③色谱条件的优化；④花青苷组分分析；⑤花青苷含量分析；2拟解决的关键问题及创新之处2（1）拟解决的关键问题①紫色马铃薯花青苷最佳提取条件的确定；②紫色马铃薯花青苷的分离纯化工艺参数的确定；③紫色马铃薯花青苷分析检测方法的建立；④紫色马铃薯花青苷中组分及含量的分析；（2）创新之处①通过响应面优化实验，对我国紫色马铃薯品种“黑金刚”花青苷提取纯化工艺条件优化，获得制备高纯度紫色马铃薯花青苷的最佳提取纯化工艺参数。

②首次应用超高效液相—三重四级杆串联质谱技术，对我国紫色马铃薯花青苷组分定性定量分析研究。技术路线3提取、离心马铃薯清洗、切片、干燥、粉碎浸膏薯粉薯粉花青苷提取液纯品马铃薯花青苷单组分含量待测样纯化、旋转蒸发、真空干燥浓缩溶解uplc检测加工原料图1紫色马铃薯花青苷提取纯化及组分研究技术路线图2拟采用的方法和手段处4（1）紫色马铃薯花青苷的提取工艺研究采用酸性乙醇回流提取法对紫色马铃薯进行花青苷类物质的提取，以得率为响应值，在单因素实验的基础上，通过响应面法优化得到紫色马铃薯花青苷提取的最佳工艺参数（2）紫色马铃薯花青苷纯化工艺研究对五种大孔树脂进行试验筛选，选择较优大孔树脂对紫色马铃薯花青苷分别静态吸附解吸附和动态吸附解吸附条件研究，确定最佳纯化工艺条件。（3）紫色马铃薯花青苷组分定性定量研究对紫色马铃薯花青苷提取液干燥浓缩，用6%甲酸水溶液溶解定容于25ml容量瓶，0.4um水系滤膜过滤后进样，综合色谱保留时间，质谱分析以及相关参考文献对花青苷组分和含量进行分析鉴定。实验方案5（1）紫色马铃薯花青苷提取工艺技术研究①料液比、乙醇浓度、PH及提取温度、提取时间的确定：根据花青苷得率确定最佳提取工艺。

②响应面试验：根据单因素实验结果，采用响应面法，优化花青苷提取工艺参数。③验证试验：对响应面实验的结果进行验证，确定紫色马铃薯花青苷最佳工艺参数。①大孔树脂的筛选和预处理对花青苷的性质、树脂的极性、比表面积、平均孔径及生产经验等多方面加以考察，预筛选了D101、HDP100A、HDP450A、NK-9、AB-85种树脂并进行比较筛选实验，选择分离效果最好实验用的树脂。②静态吸附、解吸附研究量取一定量预处理后的优选树脂于三角瓶中，加入一定花青苷溶液，充分搅拌每隔一定时间测量色素液吸光值，分别考察花青苷溶液液浓度、PH对吸附的影响。量取一定量吸附饱和的优选树脂于三角瓶中，加入一定量的酸性乙醇溶液液，充分搅拌每隔一定时间测量花色溶苷液吸光值，分别考察乙醇浓度/PH对解吸附的影响。③动态态吸附、解吸附研究量取一定量预处理后的优选树装湿法装柱，将花青苷溶液以一定流速通过柱，每10ml收集一次，测定其吸光值，考察不同吸附流速对吸附的影响；再用酸性乙醇溶液以不同流速洗脱，每2ml收集一次，测定其吸光值，考察不同洗脱流速对洗脱的影响。④纯化效果测定选用1cm比色皿,在紫外-可见分光光度计上在其最大吸波长收处的测ABS值,以公式E=AR/m计算出色价，并进行纯化效果比较。（2）紫色马铃薯花青苷纯化工艺研究（3）紫色马铃薯花青苷的组成成分分析

①紫色马铃薯花青苷定性分析：采用UPLC/MS-MS对紫色马铃薯花青苷提取液进行全扫描分析,对图中的主要峰进行质谱分析得到含有不同质核比的准分子离子峰。根据准分子离子峰的质谱分析分别对这些准分子离子进行子离子扫描，并对得到的子离子碎片进行分析，,综合色谱保留时间，质谱分析以及相关研究对花青苷组分和含量进行分析鉴定。

②紫色马铃薯花青苷定量分析：以牵牛花素-3-