基因表达分析

基因及基因表达的定性及定量分析策略一、基因的结构特点结构基因

结构基因的特点原核生物：连续、无内含子，无需剪接加工等。真核生物：二、基因的定量及定性分析基因的组成基因的染色体位置基因的拷贝数（一）DNA序列测定1965,R.HollytRNA1977,F.Sanger:双脱氧末端终止法

φX174DNA序列测定1977,A.Maxam，W.Gilbert:化学降解法1986,Smith:

四色荧光标记1987,ABI公司:DNA测序仪Sanger双脱氧末端终止法Maxam-Gilbert

化学裂解法

（二）基因拷贝数的分析SouthernblotPCR技术

核酸分子杂交分子杂交（简称杂交，hybridization）是核酸研究中一项最基本的实验技术杂交的基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子（heteroduplex）杂交双链可以在DNA与DNA链之间形成，也可在RNA与DNA链之间形成杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性利用探针（probe）与靶DNA杂交，可识别靶DNA中的特异核苷酸序列探针：探针是指带有某些标记物（如放射性同位素32P，荧光物质异硫氰酸荧光素等）的特异性核酸序列片段。核酸分子杂交的基本原理DNA变性方法热变性：90~100℃酸碱变性：常采用碱变性化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(meltingtemperature,Tm)DNA复性或杂交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等影响杂交的因素核酸分子的浓度和长度浓度大，复性快；分子量大，复性慢温度离子强度杂交液中的甲酰胺核酸分子的复杂性非特异性杂交反应预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA分子杂交的基本方法Southern印迹法Northern印迹法斑点印迹杂交原位杂交Western印迹法液相杂交Southern印迹杂交1975年，英国Southern创建DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。Southernblot

核酸探针分子在一定条件下与结合在固相支持物上的具有一定同源性的DNA分子可以完全或部分退火形成双链，通过检测探针信号，可对待检测DNA进行定性或半定量分析。Southern杂交(Southernbloting)的主要步骤待测DNA样品的制备、酶切待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备

Southern杂交杂交结果的检测

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

PCR技术

发明：故事发生在1983年的春夏之交

KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……PCR不只是一个方法改进1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远Goodidea+workhard+publish=Success生物学领域几乎无处不用基因、DNA片段的克隆人工基因构建DNA序列测定基因定点突变基因型（突变）检测，SNP分析，遗传背景分析生物物种鉴定，系统进化研究基因表达量研究（real-timePCR）/基因表达谱研究（DNAchip,SAGE）医学领域疾病基因检测/遗传病的产前诊断致病病原体的检测肿瘤治疗中癌基因的检测

会推广到大部分疾病治疗前的检测

DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证其他:

动、植物检疫（转基因动植物检测）

原位杂交(insituhybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态核酸原位杂交的基本步骤细胞或组织的固定：载玻片组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质探针的选择和标记杂交杂交结果检测原位杂交技术（insituhybridization,ISH）原位杂交技术可分析基因在染色体上的位置(a)SomaticchromosomeandnucleiofAlliumfistulosumafterDAPIstainingandfluorescenceinsituhybridizationwithlabellednon-codingsatellitesequences(greensignalsforAlexa488)and45SrDNA(redsignalsforrhodamine)usingconventionaldetectionsystems.(b)A.fistulosumchromosomesafterinsituhybridisationwiththesameprobes.Thebiotinylatednon-codingsatelliteprobewasdetectedwithQD565streptavidinconjugate(greensignal,arrowed)yieldingonlyveryweakandfewsignals.Incontrast,theconventionalantibodydetectionof45srDNAloci(inred)resultedinastronghybridizationsignal.Mülleretal.JournalofNanobiotechnology20064:5

doi:10.1186/1477-3155-4-5

（三）基因表达的定量及定性分析RNA的定性与定量分析蛋白质的定性与定量分析RNA的定性与定量分析NorthernblotNorthern印迹杂交(Northernbloting)检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳转膜：不需变性RT-PCR

是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析。

蛋白质的定性与定量分析WesternblotSDS和Western分析

步骤：收集蛋白

样品电泳转膜封闭一抗孵育二抗孵育蛋白检测

Western

杂交印迹法(Westernbloting)检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法主要步骤：蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：NC膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应流式细胞术流式细胞术（fluorescence-activatedcellsorting,FACS）可在细胞水平上分析特定蛋白质流式细胞术（flowcytometry）免疫组化免疫组化(immunohistochemistry)

可对细胞内或组织中的特定基因表达产物进行定位和半定量分析

生物芯片

生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。生物芯片的分类(1)DNA芯片(Genechip,DNAchip,DNAmicroarray)(2)蛋白质芯片(Proteinchip)(3)芯片实验室(Lab-on-a-chip)基因芯片：是指将大量探针分子固定在物体表面，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和系列信息。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因组信息而显示巨大威力。目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变等许多方面。基因芯片蛋白芯片：是以蛋白质代替DNA作为检测对象，比基因芯片更进一步接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。蛋白芯片芯片实验室：是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品制备、生化反应和检测分析的全过程集约化，形成微型分析系统。目前，这种形式尚处于研发阶段。芯片实验室

DNA芯片技术的基本原理

DNA芯片技术的基本原理是分子识别，与Southern杂交和Northern杂交同出一理，即DNA的碱基互补配对和序列互