酶工程-第七章

第七章

酶的发酵生产第一节酶的生产方式第二节产酶工艺条件及其调节控制第三节微生物发酵产酶第四节植物细胞物发酵产酶第五节动物细胞发酵产酶酶的生产是指通过各种方法获得人们所需酶的技术过程。酶的生产是酶工程的首要任务，只有通过生产获得酶以后，才有可能进一步进行各项酶学研究，也才有可能进行酶的改性和酶的应用等。提取分离法：传统方法酶的生产生物合成法：20世纪50年代以来主要方法化学合成法：实验室阶段经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术过程称为生物合成法。一、生产流程：首先要经过筛选、诱变、细胞融合、基因重组等方法获得优良的产酶细胞，然后在人工控制条件的生物反应器中进行细胞培养，通过细胞内物质的新陈代谢作用，生成所需的酶和各种代谢产物，再经过分离纯化得到所需的酶。酶发酵生产的一般工艺流程

二、方法根据所使用细胞种类的不同：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的生产方法称为酶的发酵法生产。根据微生物细胞培养方式的不同，可分为液体深层培养发酵、固体培养发酵、固定化细胞发酵、固定化原生质体发酵等。微生物发酵产酶植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶生物合成法动、植物细胞培养产酶，也应先获得优良的产酶细胞，然后在人工控制条件的生物反应器中培养，经过细胞的生命活动合成酶，再经分离纯化得到所需的酶。三、特点生物合成法与提取分离法比较，具有生产周期较短，酶的产率较高，不受生物资源、地理环境和气候条件的影响等显著特点。生物合成法对发酵设备和工艺条件的要求较高，在生产过程中必须进行严格的控制。第一节酶的生产方式酶在细胞内合成的过程称为酶的生物合成。在酶的生产过程中，首先要选择优良的产酶细胞，再在适宜的培养基中培养，在一定的条件下通过细胞的生命活动进行酶的生物合成，然后经过分离得到所需要的酶。一、细胞的选择虽然所有的生物体细胞在一定条件下都能合成多种多样的酶，但是在酶的生产中使用的细胞必须根据需要进行严格的选择与培育。须具备以下条件：选择条件⑴酶的产量高⑵容易培养和管理⑶产酶稳定性好⑷利于酶的分享纯化⑸安全可靠，无毒性1、微生物产酶的微生物包括细菌、放线菌、霉菌、酵母等。已广泛运用于酶的发酵生产中。常用的产酶微生物：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、黑曲霉、米曲霉、青霉菌、木霉、根霉、毛霉、红曲霉、啤酒酵母、假丝酵母等。2、植物细胞主要用于色素、药物、香精、酶等次级代谢物生产。常用的产酶植物细胞有：见教材。3、动物细胞主要用于疫苗、抗体、激素、多肽、酶等功能蛋白质的生产。动物细胞模式图植物细胞结构细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um200～3001～1010～100倍增时间/h﹥120.3-6﹥15营养要求简单简单复杂光照要求大多数要求不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感非常敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、单克隆抗体、酶等植物、动物、微生物细胞的特性比较二、培养基的配制在设计和配制培养基时，首先要根据不同细胞和不同用途的不同要求，确定各种组分的种类和含量，并调节好pH值，以满足细胞生长、繁殖和新陈代谢的需要。不同的细胞对培养基的要求不同；同一种细胞用于生产不同物质时，所要求的培养基有所不同；甚至在不同的生理阶段，对培养基的要求也有所不同。必须根据细胞的需要配置不同的培养基。1、培养基的基本组分⑴碳源既是营养物质也是能源物质。选择要求：①符合细胞营养要求和代谢调节的需要。大多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物；植物细胞通常以蔗糖为碳源；动物细胞则以谷氨酰胺或谷氨酸为碳源。②来源充分、价格低廉、有利于发酵工艺条件并容易使酶分离纯化。某些碳源物质对酶生物合成具有代谢调节的功能。⑵氮源氮源是细胞生长、繁殖的重要营养物质，也是酶分子的主要组成元素。氮源可分为有机氮源和无机氮源。有机氮源主要是各种蛋白质及其水解产物；无机氮源是各种含氮的无机化合物。①选择要求：动物细胞要求氨基酸、蛋白胨等有机氮源；植物细胞主要使用铵盐、硝酸盐等无机氮源；微生物细胞中，异养型细胞要求有机氮源，自养型细胞可以采用无机氮源，一般微生物采用混合氮源。②注意事项A)使用无机氮源时，铵盐和硝酸盐的比例对细胞的生长和新陈代谢有显著影响；B)碳氮比（C/N）对酶的产量有显著影响。⑶矿物质提供细胞生命活动所需的各种无机元素，并对细胞内外的pH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。根据需要量可分为大量元素和微量元素。大量元素主要指P、S、K、Na、Ca、Mg、Cl等；微量元素主要指Cu、Mn、Zn、Mo、Co、Br、I等。微量元素的需要量应严格控制，过量反而会影响细胞的生命活动。矿物质通过在培养基中添加无机盐提供。一般采用添加水溶性的硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐或硝酸盐。⑷生长因子指细胞生长、繁殖所必须的微量有机化合物。主要包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、生长激素等。嘌呤、嘧啶是某些辅酶或辅基的成分；维生素是辅酶的成分；动植物生长因素对细胞的生长、分裂具有调节作用。三、微生物培养基用于微生物培养和发酵生产的各种培养基的总称。不同的微生物生产不同的酶，所使用的培养基成分不同。在微生物培养基中，碳源一般采用淀粉或其水解产物，氮源一般采用同时含有有机氮源和无机氮源的混合氮源，矿物质和生长因子则根据微生物生长的需要进行添加。四、植物细胞培养基用于植物细胞培养和生产各种产物的培养基。1、植物细胞培养基的特点⑴生长和代谢需要大量矿物质。培养液中大量元素的浓度一般为102~3×103mg/L（P41B3-2），微量元素的浓度一般为10-2×30mg/L（P42B3-3）⑵需要多种生长因子（维生素和生长激素）。如VB1、VB6、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。培养液中维生素的浓度一般为0.1~100mg/L（P42B3-6），植物生长激素的浓度一般为0.1~10mg/L。⑶氮源一般要求为无机氮源。⑷碳源一般为蔗糖，浓度为2%~5%。2、常见植物细胞培养基MS培养基、B5培养基、White培养基、KM-8P培养基。（见教材）3、植物细胞培养基的配置通常将各种组分分成大量元素液、微量元素液、维生素溶液和植物激素溶液等几大类（10倍或100倍母液，置于冰箱保存）。使用时，将母液按配方比例混合、稀释后加入培养基。五、动物细胞培养基用于动物细胞培养和生产各种产物的培养基。1、动物细胞的组分⑴氨基酸：必须加入8种必须氨基酸（赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸）以及半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等。⑵维生素：在血清含量低或无的培养基中须补充B族维生素，有的还须补充Vc。⑶矿物质：必须添加含有大量元素的无机盐类，如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO33-、SO42-、Cl-、HCO3-等用于调节培养基的渗透压。微量元素可由血清提供，在无血清的培养基中，需要添加Fe、Cu、Zn、Se等。⑷葡萄糖：葡萄糖含量较高的培养基中容易产生乳酸。研究表明，在动物细胞培养基中，细胞所需的能量和碳素来自谷氨酰胺。⑸激素：培养过程中需要胰岛素、生长激素等。动物细胞所需的激素一般在血清中已存在，在无血清或低血清的培养基中须添加适量的激素。⑹生长因子：血清中含有的各种生长因子能够满足动物细胞生长繁殖的需要。在无血清或低血清的培养基中，需要添加适量的表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等。第二节产酶工艺条件及其调节控制在酶的生产过程中，除了选择性能优良的产酶细胞和配置适宜的培养基以外，还必须进行产酶工艺条件的优化控制，以满足细胞生长、繁殖和产酶的需要。保藏细胞细胞活化细胞扩大培养分离纯化酶固定化细胞预培养产酶无菌空气原生质体固定化原生质体培养基酶生产工艺流程一、细胞活化与扩大培养为了保持细胞的生长、繁殖和遗传特性，可通过各种保藏方法进行细胞的贮藏。1、细胞活化在细胞应用过程中，保藏的细胞须先接种于新鲜培养基上，在一定的条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复，此过程称为细胞活化。2、扩大培养经活化的细胞在种子培养基中经过一级乃至数级的扩大培养，以获得足够数量优质细胞的过程。⑴培养基的成分：种子扩大培养所使用的培养基一般应含有较为丰富的氮源，碳源可相对少一点。⑵培养条件：温度、pH、溶解氧等条件，应尽量满足细胞生长和繁殖的需要。培养时间一般以培养到细胞对数生长期为宜。接种量一般为培养基总量的1%~10%。二、pH的调节控制培养基的pH值与细胞的生长繁殖以及产酶关系密切。除在起始培养基应调节到适宜的pH，在产酶过程中必须根据变化的情况进行必要的调节控制。1、生长最适pH：不同的细胞，其生长繁殖的最适pH不同。细菌或放线菌：中性或偏弱碱性，pH=6.5~8霉菌和酵母：偏酸性，pH=4~6植物细胞：偏酸性，pH=5.2~5.8动物细胞：中性，pH=7.2~7.62、细胞产酶最适pH：细胞产酶最适pH通常接近于该酶催化反应的最适pH。如生产碱性、中性、酸性蛋白酶时的pH。但个别酶在其催化反应的最适条件下，产酶细胞的生长和代谢可能受到影响，其细胞产酶最适pH与酶催化反应的最适pH有所差别。如枯草杆菌碱性磷酸酶。有些细胞可同时产生若干种酶，通过控制培养的pH，可以控制各种酶之间的产量比例。3、调节控制最适pH的方法随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的pH往往会发生变化。这与细胞的特性、培养培养基的成分或生产工艺条件相关，在产酶过程中可根据需要对培养基的pH进行适当的调节。调节方法有：⑴改变培养基的组分或其比例；⑵使用缓冲液稳定pH；⑶加入适量的稀酸、稀碱溶液调节pH。三、温度的调节的控制产酶细胞只有在一定的温度范围内才能正常生长、繁殖和维持正常新陈代谢。不同的细胞有各自不同的最适生长温度。但有些细胞产酶的最适温度与细胞生长的最适生长温度有所不同，一般会低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。生产中须进行最适实验，以确定最适产酶温度。细胞在生长和产酶的过程中，由于新陈代谢作用，会不断放出热量，致使培养基的温度升高，同时由于培养基中的热量的不断扩散，培养基温度下降。两者综合的结果，决定了培养基的温度。在细胞生长和产酶的不同阶段，细胞释放的热量有较大差异；而热量的散失，受到环境温度等因素的影响。因此，应对培养基的温度进行调节控制，使培养基维持在适宜的温度范围内。调节控制的方法一般采用热水升温、冷水降温的方法。一般生物反应器均有各种热交换装置。四、溶解氧的调节控制指溶解在培养基（液体）中的氧气。一般情况下培养基的溶解氧较少。但培养基中培养的细胞主要吸收和利用溶解氧，在培养过程中溶解氧将很快被消耗完，致使细胞培养受阻。在生产过程中须不断供给氧（无菌空气），使培养基中的的溶解氧保持在一定的水平。1、溶解氧的调节控制理论：主要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断的进行补充，使培养基中的溶解量的保持在一定水平。式中：KO2——耗氧速率，mmol氧/(h.L)QO2——细胞呼吸强度，mmol氧/(h.g干细胞)或mmol氧/(h.每个细胞)Cc——细胞浓度，g干细胞/L细胞对溶解氧的需要量与细胞的呼吸强度及培养基中的细胞浓度密切相关。在酶的生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此，必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。2、溶解氧的供给一般将无菌空气通入发酵容器，在一定条件下使空气中的氧溶解到培养液中，以供细胞生命活动的需要。培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度（溶氧速率或溶氧系数）。溶氧速率指单位体积的发酵液在单位时间内所溶解的氧的量，用Kd表示，单位为mmol氧/(h.L)。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质有密切关系。一般通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积与溶氧速率成正比。另外培养液的性质，主要是黏度、气泡以及温度对溶氧速率也有明显影响。当KO2=Kd，培养液中的溶解氧的量保持恒定，可以满足细胞生长和发酵产酶的需要。3、调节溶解氧的主要方法当细胞耗氧速度发生改变时，必须相应对溶氧速率进行调节。⑴调节通气量⑸改变培养液的性质⑶调节气液接触时间⑵调节氧的分压⑷调节气液接触面积第三节微生物发酵产酶一、微生物发酵产酶的方式及其特点酶的发酵生产根据微生物培养方式的不同，分为：固体培养发酵液体深层发酵固定化细胞发酵固定化原生质体发酵1、固体培养发酵在固体或者半固体培养基中接种微生物，在一定条件下进行发酵，以获得所需酶的发酵方法。⑴主要目的：获得淀粉酶类和蛋白酶类，用于催化淀粉的蛋白质的水解。⑵工艺特点：设备简单、操作方便、麸曲中酶的浓度较高，特别适应于各种霉菌的培养和产酶。但劳动强度大，原料利用率低，生产周期长。⑵液体深层发酵在液体培养基中接种微生物，在一定条件下进行发酵，生产得到所需酶的发酵方法。适合于微生物细胞的发酵生产，也可用于动、植物细胞的培养。是目前酶发酵生产的主要方式。工艺特点：机械化程度较高，技术管理较严格，酶的产率较高，质量较稳定，产品回收率较高。⑶固定化细胞发酵是在固定化酶的基础上发展起来的发酵技术。固定化细胞是指在固定在水不溶性的载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。工艺特点：细胞密度大，产酶能力高；发酵稳定性好，可反复或连续使用；细胞固定在载体上，流失较少，可以在高稀释率的条件下连续发酵，利于自动化生产，并有利于酶的分离纯化。⑷固定化原生质体发酵指在固定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。固定化原生质没有细胞壁的屏障，有利于胞内物质透过细胞膜扩散到胞外，从而可不经过细胞破碎和提取工艺直接从发酵液中分离得到所需的酶。固定化原生质体发酵为胞内酶等胞内物质的工业化生产开辟了新途径。二、提高酶产量的措施酶的生产过程中，在选择使用优良的产酶细胞，进行发酵工艺条件的优化控制之外，所采取的措施。添加诱导物控制阻碍物的浓度添加表面活性剂添加产酶促进剂1、添加诱导物诱导物是能够使某些酶的生物合成开始或者加速进行的物质。在诱导酶的发酵过程中，添加适当的诱导物，在一定的条件下，就可以加速酶的生物合成，提高酶的产量。一般来说，不同的酶有不同的诱导物；同一种酶往往有多种诱导物。诱导物一般分三类：酶的作用底物、酶的催化反应产物和作用底物的类似物。2、控制阻碍物的浓度指能够引起某些酶的生物合成停止或减速进行的物质。阻遏作用根据作用机理的不同分为以下二种：产物阻遏除去终产物添加阻止产物形成的抑制剂分解代谢物阻遏避免使用葡萄糖避免培养基过于丰富添加一定量的cAMP3、添加表面活性剂细胞膜具有选择透性，用于控制胞外物质的吸收和胞内物质的分泌。在培养基中添加表面活性剂，能够与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，提高酶的产量。表面活性剂离子型对细胞有毒害作用非离子型Tween－80TritonX－100增加细胞通透性4、添加产酶促进剂指可以促进产酶，但是作用机理尚未阐明清楚的物质。但其能够提高酶的产量。三、酶发酵动力学发酵动力学是研究发酵过程中，细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因素对速度的影响的学科。在酶的生产过程中，研究细胞生长的动力学和产酶动力学，对于了解本科的生物合成模式、发酵工艺条件的优化控制、提高酶的产率等方面均具有重要意义。(一)酶生物合成的模式在分批培养(batchculture)过程中，细胞生长一般要经历调整期（延迟期）、指数生长期、平稳期和衰亡期四个阶段。时间/h细胞浓度/(mg/mL)OACDB

细胞生长曲线

O-A调整期A-B指数生长期B-C平稳期C-D衰亡期总细胞浓度活细胞浓度(一)酶生物合成的模式在分批培养(batchculture)过程中，细胞生长一般要经历调整期、指数生长期、平稳期和衰亡期四个阶段。时间/h细胞浓度/(mg/mL)OACDB

细胞生长曲线

O-A调整期A-B指数生长期B-C平稳期C-D衰亡期总细胞浓度活细胞浓度根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为四种模式，即：

同步合成型生长偶联型——中期合成型部分生长偶联型——延续合成型非生长偶联型——滞后合成型1、生长偶联型（又称同步合成型）酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的生物合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。时间/h细胞浓度/(mg/mL)

枯草杆菌碱性磷酸酶生物合成曲线细胞浓度酶浓度

0268410酶浓度/(U/mL)2、生长偶联型中的特殊形式——中期合成型酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所对应的mRNA是不稳定的。3、部分生长偶联型（又称延续合成型）酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的mRNA相当稳定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线4、非生长偶联型（又称滞后合成型）只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线总结：影响酶生物合成模式的主要因素1、mRNA的稳定性高：可在细胞停止生长后继续合成酶；差：随着细胞停止生长而终止酶的合成。2、培养基中阻遏物的存在不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始合成。酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。

(二)细胞生长动力学营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型µ:比生长速率（1/h）（specificgrowthrate）µmax：最大比生长速率（1/h）S：营养物浓度（生长限制基质浓度）克/LKs：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数

克/L，或mol/L(三)产酶动力学一般产酶动力学方程可表达为：式中：X——细胞浓度(g/L)

——细胞比生长速率(h-1)

——生长偶联的比产酶系数(IU/g)

——非生长偶联的比产酶速率(IU/(gh))

E——酶浓度(IU/L)

t——时间(h)生长偶联型部分生长偶联型

非生长偶联型

四、固定化微生物细胞发酵产酶固定化细胞是指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。(一)固定化细胞产酶的特点1、提高产酶率2、可以反复使用或连续使用较长时间3、稳定性好4、缩短发酵周期，提高设备利用率5、产品容易分离纯化6、适用于胞外酶等胞外产物的生产(二)固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制与游离细胞发酵工艺条件基本相同。但其工艺条件控制需要注意以下事项：1、固定化细胞的预培养2、溶解氧的供给3、温度的控制4、培养基组分的控制(三)固定化细胞生长和产酶动力学参照前节1、固定化细胞生长动力学2、固定化细胞产酶动力学3、固定化细胞连续产酶动力学五、固定化原生质体发酵产酶固定化原生质体是指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生命活动的原生质体。固定化原生质体有利于氧气和其他营养物质的传递和酶的分泌，可以显著提高酶产率。固定化原生质体发酵产酶具有操作稳定性和保存稳定性。工艺条件控制需要注意：1、渗透压的控制；2、防止细胞壁再生；3、保证原生质体的浓度。第四节植物细胞培养产酶植物细胞培养是从植物外植体中获得植物细胞，然后在一定条件下进行培养，以获得各种所需产物的技术过程。植物细胞培养培养产酶是20世纪80年代发展起来的技术，通过诱导从外植体获得植物细胞，再经筛选、诱变、原生质体融合或基因重组选育优质产酶细胞，在人工控制条件的反应器中进行培养产酶。植物细胞产酶同样具有提高产率、缩短周期、提高产量等显著优点，且不受地理环境和气候条件的影响，具有深远的意义和广阔的应用前景。一、植物细胞的特性1、植物细胞较大（直径和体积）2、生长速率和代谢速率较低，生产周期较长3、营养要求简单4、培养需要一定的光照强度和时间5、对剪切力敏感6、生产的产物不同于其它细胞培养二、植物细胞培养的特点1、产率高2、周期短3、易于管理，劳动强度低4、产品质量高三、植物细胞培养的工艺条件及其控制1、温度的控制室温下（25℃）培养，范围应控制在20~32℃。温度高有利于细胞生长，温度低有利于次级代谢产物的积累。2、pH的控制最适pH=5~6，在配制培养基时，应将培养基控制在pH=5.5~5.8。植物细胞培养过程中，pH变化较小。3、溶解氧的调节控制植物细胞代谢较慢，需氧量较小，过量的氧具有不良影响。另外植物细胞体积较大，对剪切力敏感，强烈的通风和搅拌会破坏植物细胞。4、光照的控制光照对植物细胞培养有重要影响。大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定波长的光的照射，并对光照强度和时间有一定的要求。有些次级代谢物的生物合成会受到光的抑制。5、前体的添加前体是指目的代谢物代谢途径上游的物质。在培养过程中添加前体物质可以有效的提高次级代谢物的产量。6、刺激剂的应用刺激剂可以促使植物细胞中的物质代谢朝着某些次级代谢产物生成的方向进行，提高次级代谢产物产率的提高。常用的刺激剂有微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素等微生物胞外酶。四、植物细胞培养产酶的过程以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶(SOD)为例：SOD具抗辐射、抗氧化、抗衰老等功效。1、大蒜愈伤组织的培养2、大蒜细胞悬浮培养3、