第一章基因工程的分子遗传学基础

2014-2015第一章基因工程的分子遗传学基础第一节基因和信息流一、基因的概念基因：遗传信息的基本单位，位于染色体或基因组中特定位置的一段DNA或RNA序列，可编码有特定功能的蛋白质或RNA产物。含有编码序列（外显子）、非编码区（内含子）、5’端的前导序列、3’端的尾随序列、一些表达调控元件（原核基因的弱化子、终止子、真核基因的加A信号）等。2真核基因的结构3等位基因（allele）：指一个基因突变而产生的多种形式之一。在二倍体真核生物中，等位基因成对存在于一对同源染色体的特定基因座上。在原核生物中，等位基因单独存在于染色体上或染色体外（如质粒上）。重叠基因的存在表明原核基因的编码是可以重复的，可节省碱基资源，以有限的核酸序列编码更多的信息。断裂基因的证实显示真核基因多为不连续的编码。4二、遗传的中心法则基因表达：指DNA分子经转录产生与之互补的RNA分子。5细胞分裂依赖于DNA的复制从而使染色体复制。两条互补的反向平行的DNA单链之间由众多氢键的连接，从而形成稳定的DNA双链分子。DNA合成的起始需要引物提供3’羟基，DNA聚合酶按照5’3’方向合成DNA。（一）DNA合成6也称为DNA的转录，需要RNA聚合酶的催化，以单链DNA为模板合成一条互补的RNA序列，将遗传信息从DNA传递到RNA。与DNA合成的区别：a.转录时只有一条DNA链模板，复制时两条链都作为模板。b.DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放；DNA复制，新链和母链结合形成子链。c.RNA合成不需引物，DNA复制需要引物；d.转录的底物是rRNA，复制的底物是dNTP；e.所用的聚合酶系不同。（二）RNA合成(三)蛋白质合成7

蛋白质合成涉及细胞中的翻译装置——核糖体，由大量的rRNA和核糖体蛋白组成的。DNA基因序列忠实地转录成mRNA，其三联密码子含有蛋白质合成的信息，称为遗传密码。共64个密码子，其中61个有义密码子编码20个氨基酸，3个无义密码子作为翻译的终止密码子（UGA），61个有义密码子中有一个是翻译的起始密码子（AUG），它编码甲硫氨酸。8核糖体结合到mRNA的5’端，开始蛋白质的合成。第一个氨基酸通常为甲硫氨酸。核糖体以

5’3’的方向阅读密码子结束mRNA，直到终止密码子结束。在任何DNA序列中，理论上一个蛋白质或一个多肽的连续的密码子系列称为可读框。三、基因表达的调节——操纵子模型9乳糖操纵子：6000bp操纵基因O3个结构基因：lacZ、lacY和lacA。乳糖操纵子转录的决定因素：阻遏蛋白E.ColilacIq突变：lac阻遏蛋白基因超表达，使阻遏蛋白水平大大提高，结果高度阻遏了操纵子。lac启动子突变（如lacUV5启动子突变）：虽然这类突变不改变操纵子的阻遏，但增加了启动子的活性。用IPTG诱导这两种突变的菌株，其表达可超过野生型菌株100倍。11蓝白斑筛选β-半乳糖苷酶的活性可作为基因活性的指标。可使发色底物X-gal产生蓝色产物。lacZ′基因是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含此基因的重组载体转化lacZ′互补型菌株，可转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal和IPTG的培养基上可使转化子成为蓝色菌落。12一、核酸大分子的结构第二节核酸的生物化学生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、多糖，其中核酸、蛋白质是机体的两类最基本的生物大分子，它们都属于信息分子。DNA遗传信息的载体、mRNA遗传信息传递的中介物、蛋白质

遗传信息表达的终产物。二、DNA双螺旋的变性与复性变性：指在一定条件下（高温或变性剂等）DNA双螺旋解链的过程。解链温度：在DNA变性进行到一半时的温度。对260nm紫外光的吸收率——光密度值（OD），可用来检测溶液中DNA单链或双链的浓度。复性：指DNA分子由单链状态恢复到双链结构的过程，又称退火。变性的方法：（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。变性后的理化性质变化：

粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加DNA变性曲线AT区先解链GC区后解链

阶梯式曲线GC含量与Tm值之间的关系

（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44

Tm=(G+C)%×0.41+69.3复性过程①单链分子间碰撞形成局部双链②局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离③局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列④形成完整的双链分子参数对Tm的影响对复性速率的影响碱基的成分Tm值随G-C含量的增加而增加无序列的长度Tm值随序列长度的增加而增加，当>500bp时，Tm值不受影响随序列长度的增加而上升离子浓度Tm值随Na+浓度的增加而增加最理想的Na+浓度为1.5M碱基错配比例最理想的值随碱基错配比例（%）的增加而下降随碱基错配比例而下降DNA浓度不影响Tm值随Na+浓度的增加而增加变性剂Tm值随甲酰胺和尿素浓度的增加而减少最理想的甲酰胺浓度为50%温度不适用最理想的温度是低于Tm20℃各种影响DNA变性和复性的因素第三节分子杂交分子杂交：又称为核酸分子杂交，是用一条单链DNA或RNA与另一被测单链DNA形成互补双链分子的过程，以测定某特异序列是否存在。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。杂交都必须有探针的存在。就是用同位素或非同位素，如荧光染料、生物素等标记的短片段特异DNA或RNA序列。一、原位分子杂交分两种：玻片原位杂交和膜上原位杂交。玻片原位杂交：要先制片，如中期染色体片和组织切片等。片子制好后不染色，放在缓冲液中慢慢变性，再加入探针让其复性，将没有结合的探针充分洗脱。若用同位素标记探针，须在片子涂一层乳胶或覆盖一张同样大小的X光片进行放射自显影，再观察同位素的曝光点在组织细胞或染色体上的相对位置。若用荧光标记，可用荧光显微镜直接观察。此方法用来进行染色体的基本定位或观察组织中不同的RNA分布。膜上原位杂交：将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上，这种膜只吸附单链DNA，将影印好的膜用NaOH处理，不仅可杀死细菌，还可使DNA变性吸附在膜上，再用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA吸附在膜上的空白处，称为预杂交（防止探针被吸附在背景上，干扰实验结果），膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。常用于从基因文库中钓基因。*22荧光上原位杂交（FISH）：用荧光标记的核酸探针在中期染色体上进行原位杂交，在荧光显微镜下观察，以确定与探针互补的核酸序列在染色体的位置和分布。常用作基因定位、基因诊断等。一种FISH的扩展是染色体涂染，来自特异染色体或染色体区域的一套已知克隆DNA用不同的荧光染料标记，这些染料使特异区域着色，这样在荧光显微镜下易于鉴别。如一个尚未定位的基因克隆用不同的染料标记，那么它的位置在一系列不同的染色带中被鉴别出。23二、芯片技术DNA芯片，也称基因芯片或微阵列，是利用反相杂交原理，使用固定化的探针陈列与样品杂交，通过荧光扫描和计算机分析，获得样品中大量基因及表达信息的一种高通量生物信息分析技术。24三、印迹杂交（一）DNA印迹即Southern杂交，1975年由英国人埃德温·迈勒·萨瑟恩（EdwinMellorSouthern）创建。是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析、基因突变分析、特性基因定性和定量及PCR产物分析等方面有重要价值。1、待测核酸样品的制备

1）裂解或破碎细胞

2）抽取纯化基因组DNA 3）限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段2、待测DNA样品的电泳分离

1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶

2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子

DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小相同的分子处于同一条带

3）分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记263、凝胶中核酸的变性(碱变性)凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性为单链DNA，中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。使用稀HCl使DNA脱嘌呤，这样可以让DNA片段变短，提高转移效率。4、Southern印迹指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。271）固相支持物的选择a.理想的固相支持物应具备的特性： ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 ⑤非特异吸附少b.常用的固相支持物

①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低2）Southern印迹的常用方法a.毛细管虹吸印迹法

利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中 的DNA转移到固相支持物上。基本原理：

容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。55b.电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。c.真空转移法

此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤 膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。5、Southern杂交

1）预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交，缓冲液为不含DNA探针的杂交液。

2）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交。

3）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA。6、杂交结果检测1）放射自显影：适用于放射性核素标记的探针。2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针。（二）RNA印迹（Northern印迹杂交）

1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同

2、对待检样品中mRNA的长度和丰度进行分析

3、探针可用DNA或RNA片段

4、待测样品为总RNA或mRNA

RNA印迹可以测定某基因表达的时空特异性。37Northern印迹与Southern印迹的不同点

1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性。前者采用的变性剂是甲醛或聚乙二醇，后者只是采用NaOH。

2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理。

3、靶核酸为RNA。（三）蛋白质印迹（Westernblotting）

1、用来检测蛋白质而不是检测核酸。

2、不用毛细管原理，而是通过电场的作用将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质电泳带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定蛋白质的技术。 （四）斑点及狭缝印迹杂交

1、斑点印迹为圆形

2、狭缝印迹为线状

3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品

5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量40东方印迹（Easternblotting）用来检测真核细胞中蛋白质翻译后修饰的技术。检测目标是蛋白质上特定的修饰基因或部位，如脂肪酸链、糖基、磷酸化的氨基酸等。利用双向电泳分离蛋白质，再转到膜上，再用特定探针去检测。西南方印迹（Southwesternblotting）结合蛋白质印迹和DNA印迹的特点，用于检测序列特异性DNA和蛋白质结合。首先用SDS的方法将蛋白质分离开并转移到膜上，在尿素的存在下去除SDS，使蛋白质复性，最后用放射性双链DNA探针与吸印在硝酸纤维素膜的核提取蛋白结合，来鉴别DNA结合蛋白。用于检测蛋白的分子质量。（五）其他印迹41四、异源双链定位法和R环定位法异源双链定位法：将异源DNA双链变性后进行分子杂交，然后在电镜下观察，如发现有环形不配对的部分，表明可能存在缺失。R环定位法：将标记的mRNA和变性后的待测双链DNA进行杂交，制片后，可以以观察到R环，这是由于RNA和DNA形成的双链比原来的DNA双链更为稳定，将一条DNA单链置换了出来，表明这些释放出的环状单链DNA部分是内含子。主要用来进行基因定位、内含子的探测及DNA缺失的确定等。42第四节基因工程中常采用的酶类限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类—用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化检测等。一、限制性核酸内切酶二、DNA连接酶和激酶三、DNA聚合酶和RNA聚合酶一、限制性核酸内切酶DNA体外重组，首先必须获得需要重组和能够重组的DNA片段用限制性内切核酸酶酶切DNA分子是获得这种DNA片段的主要途径。限制性内切酶－基因的剪刀（一）限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease）概念是一类能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其附近切断双链DNA磷酸二酯键的核酸水解酶。按其性质可分为3大类。Ⅰ型有特定的识别顺序，但是切点与之有一定距离。反应要求有ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。酶由不同的α、β和γ亚基组成。全酶兼有限制性内切酶的活性和甲基化酶的活性。Ⅲ型与Ⅰ型有相似特征，只是切点距识别顺序距离是严格的。Ⅱ型酶，独立的限制性核酸内切酶，不兼有甲基化酶的活性，切点在识别顺序中。Ⅱ型的酶只有单一的亚基，以二体或四体发挥作用。上述3个酶系统中，只有II型限制酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。如果没有专门说明，通常所说的限制性内切是Ⅱ型酶。限制性内切核酸酶一般以酶源生物的属名和种名前1、2个字母以及株（型）代号来命名。如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字表示。例如，从HaemophilusinfiuenzaeRd中提取到的第3种限制性内切核酸酶被命名为HindⅢ（前三个字母必须是斜体）。（二）限制性内切核酸酶特点1.识别顺序和酶切位点限制性内切核酸酶在双链DNA上能够识别的核苷酸序列被称为识别序列。1）多数识别４-8个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；2）富含GC3）对称性—双对称这些酶的识别顺序大都具有180°旋转对称的特征。EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’4）切点大多数在识别顺序之内，也有例外DNA在限制性内切核酸酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为酶切位点，可用↓表示。限制性内切核酸酶在DNA上的酶切位点一般是在识别序列内部，如：C↓GATCC、AT↓CGAT、GTC↓GAC、CCGC↓CC、AGCGC↓T等。少数限制性内切核酸酶在DNA上的酶切位点在识别序列的两侧，如：↓GATC、CATG↓、↓CCAGG等。5）限制酶切后产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH2.

末端种类有时切口可带有一个短的单链末端，如EcoRⅠ和HindⅢ。这种短的单链末端，称为“粘性末端”，它与对应的单链末端很容易恢复原来的碱基配对，而粘接成双链。

1）3’-端突起，个数为2或4个核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

2）5’-端突起，个数为2或4个核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’3）

平齐末端切口有时是平头的，即双链的切点位置相同，如AluⅠ和HaeⅢ等。

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

4）非互补的粘性末端

a）切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

b）能识别简并顺序的，如：AvaI

AvaI5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG；CTCGGG；CCCGAG；CTCGAG

酶切位点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATGNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’-CCTACNNNNNNNNNNNNNNN-5’FokI37℃5’-GGATGNNNNNNNNN-OH3’3’-CCTACNNNNNNNNNNNNNN-P5’5）相容性末端有些限制性内切核酸酶虽然识别序列不同，但是酶切DNA分子产生的DNA片段具有相同的黏性末端，称这样的一组限制性内切核酸酶为同尾酶（isocaudarner）。

如TaqI，ClaI和AccI为一组同尾酶，其中任何一种酶酶切DNA分子，均产生5’-CG黏性末端。同尾酶在基因重组操作中有特殊的用途。当把同尾酶切割的DNA片断与原来的限制性内切酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在。有的限制性内切核酸酶可识别2种以上的核苷酸序列。如AccⅠ即可识别GTATAC，又可识别GTCGAC；DdeI可识别的核苷酸序列有CTAAG、CTTAG、CTGAG和CTCAG共4种。另有一些限制性内切核酸酶虽然来源不同，但是具有相同的识别序列。这样的限制性内切核酸酶被称为同裂酶（isoschizomer），如BamHI和BstI为同裂酶，识别序列GGATCC。同裂酶可以具有不同的酶切位点（2种不同的限制性内切核酸酶），也可以具有相同的酶切位点（往往是从不同生物中提取到的同一种限制性内切核酸酶）。（三）限制酶的星反应（staractivity）特点：限制酶识别序列特异性降低具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件a识别序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,71.亚乙二醇(45%)；2.甘油(12%)；3.乙醇(12%)；4.高酶/DNA比(>25U/μg)；5.Mn++代替Mg++；6.pH8.5；7.二甲基亚砜(8%)；8.无NaCl。（四）其它特异性的内切酶1.λ末端酶（λterminase）：

识别结合特异性地切割λDNA的cos序列。

5’-GGGCGGCGACCTN--3’N--5’，出现的频率约412

2.Omega核酸酶（I-SceI）：

由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418，其识别顺序为5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’

TATT3.I-PpoI：来自于Physarumpolycephalum

识别序列：CTCTCTTAAGGTAGCAATT（五）限制性内切核酸酶酶切1.反应系统限制性内切核酸酶同其他酶类一样，反应系统除酶本身外，还应包括反应底物和反应缓冲液，并且还需要合适的反应温度。限制性内切核酸酶的反应底物是环状的或线形的双链DNA分子（或DNA片段）。厂家提供某种限制性内切核酸酶时一般同时提供一种相应的反应缓冲液。大多数限制性内切核酸酶的最适反应温度是37℃。2.酶切方法常用的酶切方法有单酶切、双酶切和部分酶切等几种。（1）单酶切法这是用一种限制性内切核酸酶酶切DNA样品。若DNA样品是环状DNA分子，完全酶切后，产生与识别序列数（n）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同。若DNA样品本来就是线形DNA片段，完全酶切的结果，产生n+1个DNA片段数，其中有2个片段的一端仍保留原来的末端。（2）双酶切法这是用2种不同的限制性内切核酸酶酶切同一种DNA分子的方法。

考虑缓冲液DNA分子无论是环状DNA分子，还是线形DNA片段，酶切结果，DNA片段的2个黏性末端是不同的（用同尾酶酶切除外）。环状DNA分子完全酶切的结果，产生的DNA片段数是两种限制性内切核酸酶识别序列数之和。线形DNA片段完全酶切的结果，产生的DNA片段数是两种限制性内切核酸酶识别序列数之和加1。（3）部分酶切指选用的限制性内切核酸酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的酶切。导致部分酶切的原因底物DNA的纯度低、识别序列的甲基化、酶用量不足、反应时间不够以及反应缓冲液和温度不适宜等。部分酶切会影响需要的DNA片段的得率。但是从另一方面说，有时根据重组DNA的需要，还专门创造部分酶切的条件，以获得需要的DNA片段。AB标示反了？BA（六）限制酶的用途

1、DNA重组

2、限制酶（物理）图谱绘制3、突变分析（RFLP分析）4、限制酶的部分酶切与完全酶切二、DNA连接酶和激酶基因工程的实质是基因重组。基因之所以能够在试管内进行重组，是因为DNA片段在DNA连接酶作用下能够进行连接，组成重组DNA分子。1.DNA连接酶（DNAligase）概念能催化双链DNA片段紧靠在一起的3’-OH末端与5’-磷酸末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前用于试管中连接DNA片段的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。E.coli

DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，而T4DNA连接酶既可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。2.DNA片段之间的连接（1）具互补黏性末端片段之间的连接连接反应可用E.coliDNA连接酶，也可用T4DNA连接酶。待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性内切核酸酶酶切的，连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。如果是用2种同尾酶酶切的，虽然产生相同的互补黏性末端，可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子往往消失了原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列。（2）具平末端DNA片段之间的连接连接反应必须用T4DNA连接酶（图b）。如果用2种不同限制性内切核酸酶酶切产生的平末端DNA片段之间进行连接后的DNA分子失去那2种限制性内切核酸酶的识别序列。如果2个DNA片段的末端是用同一种限制性内切核酸酶酶切后产生的，连接后的DNA分子仍保留那种酶的识别序列，有的还出现另一种新的限制性内切核酸酶识别序列。（3）DNA片段末端修饰后进行连接

待连接的两个DNA片段经过不同限制性内切核酸酶酶切后，产生的末端未必是互补黏性末端，或者未必都是平末端，因此无法进行连接,在这种情况下，连接之前必须对两个末端或一个末端进行修饰。修饰的方式主要是采用核酸外切酶Ⅶ（ExoⅦ）将黏性末端修饰成平末端；采用末端转移酶将平末端修饰成互补黏性末端；有时为了避免待连接的两个DNA片段自行连接成环形DNA，或二聚体、多聚体，可采用碱性磷酸酯酶将其中一种DNA片段5’末端的一P修饰成一OH。（4）DNA片段加衔接头后连接如果要连接既不具互补黏性末端又不具平末端的两种DNA片段，除了上述用修饰一种或两种DNA片段末端后进行连接的方法外，还可以采用人工合成的衔接头。先将衔接头连接到待连接的1种或2种DNA片段的末端，然后用合适的限制性内切核酸酶酶切衔接头，使待连接的两种DNA片段具互补黏性末端，最后在DNA连接酶催化下使两种DNA片段连接，产生重组DNA分子。此外，也可以根据两DNA片段的末端，选用合适的衔接头直接把两DNA片段连接在一起。3、激酶

通过催化ATP的γ-磷酸基共价附着在靶分子上，磷酸化特异的底物。T4噬菌体多核苷酸激酶是一种磷酸化DNA或RNA5’羟基的酶。用于[γ-32P]ATP标记DNA5’端，也可对缺乏5’-磷酸的DNA或人工接头进行磷酸化。

细菌的碱性磷酸酯酶是一种去除DNA5’-磷酸的酶。用于T4噬菌体多核苷酸激酶进行末端标记前除去5’-磷酸，或用来处理经切过的载体DNA，防止其重新环化而降低转化效率。T4-多核苷酸磷酸激酶(T4-PNP)2009-11-2666三、DNA聚合酶和RNA聚合酶以单链DNA作为模板，DNA聚合酶和RNA聚合酶可直接合成互补的核酸。DNA合成时需要具有3’羟基的DNA或RNA作为引物，而RNA可起始从头合成。RNA聚合酶是催化RNA合成的酶。DNA聚合酶的特性PCR反应时，需要用耐高温的DNA聚合酶，即TaqDNA聚合酶，其在75℃具有最佳活性，对95℃高温具有良好的稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolymeraseI）基本用途

T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)T4DNA酶的基本特性：有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合 酶活性。在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切－在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。－在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。基本用途2009-11-2655基因工程中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNA

DNA连接酶

DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段

反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5′→3′聚合、3′→5′外切活性，而无5′→3′外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3′末端标记等①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针在3´羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基83测序酶：经修饰后消除了3’5’外切酶活性的T7DNA聚合酶。

在体外反应中用含有双脱氧的核苷进行链的终止。反转录酶：用来产生互补DNA（cDNA）；用于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段可进行放射标记。末端转移酶：反应特点：底物：dNTP及衍生物，>3个核苷酸，要求3’-OH 端，需要单链DNA作为引物，以3’-突起端的双链DNA为最高，亦可用于双链DNA加尾。用于3’-加尾，便于两DNA分子重组;3’-末端标记84测序酶：经修饰后消除了3’5’外切酶活性的T7DNA聚合酶。

在体外反应中用含有双脱氧的核苷进行链的终止。反转录酶：用来产生互补DNA（cDNA）；用于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段可进行放射标记。末端转移酶：反应特点：底物：dNTP及衍生物，>3个核苷酸，要求3’-OH 端，需要单链DNA作为引物，以3’-突起端的双链DNA为最高，亦可用于双链DNA加尾。用于3’-加尾，便于两DNA分子重组;3’-末端标记85第五节研究DNA和RNA的方法一、核酸的分离纯化分离提取的核酸样品，分为DNA和RNA，由于不同的实验要求，需用不同的方法进一步纯化，核酸纯化的主要目标是去除其中的蛋白、多糖、多酚、盐离子等杂质。核酸的纯化、浓缩、

沉淀、定量、保存。（一）核酸的纯化DNA作为核酸内切酶的底物，应具备一定的纯度，其溶液中不能含有酚、氯仿、乙醚、大于l0mmol/L的EDTA、去污剂（如SDS）以及过量的盐离子浓度，这些因素的存在均可不同程度地影响限制性内切酶的活性。核酸纯化的方法很多，不同的方法对应于不同的研究目的。酚/氯仿抽提、超速离心、柱层析、分子杂交、免疫沉淀、凝胶电泳等方法。在此仅介绍从核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法。这个方法的标准程序是酚/氯仿（1:1）抽提1次，氯仿抽提1-2次，如果情况需要可再重复几次。1、酚/氯仿抽提法的基本原理混合使用酚、氯仿（蛋白质变性剂），以增加去除蛋白杂质的效果。因为酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶的活性；而且酚能溶解10％-15％的水，从而能溶解一部分核酸，同时氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。最后用氯仿抽提处理，是为了去除核酸溶液中的痕量酚。如果所提核酸的酶反应条件要求极严格，最可靠的方法是再用水饱和的乙醚抽提一次，以彻底去除核酸样品中的痕量酚与氯仿，然后在68℃水浴中放置10分钟，使痕量乙醚蒸发掉。2.酚/氯仿抽提法的基本步骤如果DNA或RNA体积较小，一般于1.5ml的Eppendorf离心管中进行，若体积较大则于10-50ml的离心管中进行。1）在每一样品中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液。2）若DNA片段小于l0kb，可以振荡混合；

大于l0kb，则反复轻柔地转动离心管，形成乳状液。（切勿使用高速的振荡器）3）室温下，于10000×g以上

（一般要10000-12000rpm以上）离心l0分钟。4）吸取上层水相于一个新的离心管中。如果DNA的分子量较大，可将枪头的尖端剪去一截，以增大枪头口的直径。吸取速度要慢而匀，这样既减少吸液时的机械剪切，又可尽量避免吸取界面处的蛋白杂质层。5）加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）溶液，重复步骤(2)、(3)、(4)。6）向核酸溶液中加入等体积的水饱和乙醚，混匀，静止2-5分钟，分层，含核酸样品的水相在下层（乙醚高度挥发、易燃，应在通风厨中工作）。7）移弃上层乙醚。8）将核酸溶液于68℃水浴5-10分钟，不时用手指弹动管壁，使乙醚蒸发。

（第6-8步一般不用）9）乙醇沉淀核酸。3.酚/氯仿抽提法的注意事项1）必须采用Tris缓冲液平衡后的重蒸酚，pH必须在8.0，中性尤其是酸性酚，在核酸沉淀中会导致DNA沉淀而随杂质一块丢失。2）该法只能去除核酸中的蛋白杂质，而多酚、多糖等杂质则很难除去。3）如果对DNA去蛋白效果要求更高，可以在酚/氯仿/异戊醇抽提后又重复1次抽提。4）如果要求非常彻底地去除产物中的痕量酚，可以在氯仿/异戊醇抽提后又重复一次抽提。5）常规实验中一般对痕量残存氯仿的去除效果要求不太高，可以省略乙醚抽提过程，氯仿/异戊醇抽提后直接用乙醇沉淀。6）根据DNA片断长度及研究目的而选择合适的混匀方式和力度很重要，总的原则是让酚/氯仿/异戊醇，或氯仿/异戊醇与核酸水相混匀成乳状液并保持10分钟左右才能达到去蛋白的效果。7）若是大分子量DNA可以将样品在预冷的STE（pH7.8）中充分透析，以减少对大分子量核酸的机械损伤。8）乙醚在室温下应保存在通风橱中或试剂架上。千万不能放入冰箱（冰箱自动化霜后起动打火，挥发的乙醚发生爆炸）。9）在酚中加入0.1%8-羟基喹啉可以延长保存时间和提高纯化效果。（二）核酸的浓缩一般情况下抽提的核酸液在去除杂质后，可直接进行沉淀，而无需进行核酸的浓缩。但若溶液中DNA含量低，并且体积较大，不易进行乙醇沉淀，可以采用以下2种方法，减少溶液体积并浓缩核酸。1.固体聚乙二醇（PEG）吸水浓缩法1）将DNA溶液装入透析袋，透析完毕后，置于一平皿中。2）加人适量PEG（分子量6000-12000）包埋透析袋。3）待PEG吸湿（大约10分钟）后，再换新的PEG颗粒包围透析袋，

重复步骤（2）、（3），直到体积合适。4）用TE悬浮透析袋，漂洗净表面的PEG。5）取出透析袋中的DNA溶液，分装贮存备用，

或再用乙醇沉淀回收DNA。2.丁醇抽提浓缩法正丁醇或仲丁醇抽提水溶液时，可将溶液中的水吸入有机相，而溶液中的溶质（DNA）则不会分配到正丁醇中去。利用该特性，可以显著减少DNA溶液的体积。1）在DNA溶液中，加入等体积丁醇，充分混合，（加入过多的丁醇会使溶液中的水迅速丢失，而导致DNA沉淀）2）以1600×g离心1分钟，弃上层有机相。3）重复步骤(1)、(2)，以达到所需体积。4）用水饱和乙醚抽提2次，可去除痕量丁醇，然后在68℃条件下，蒸发去除痕量乙醚。丁醇抽提，并不能去除溶液中盐类，抽提后可利用乙醇沉淀回收DNA。（三）核酸的沉淀1.有机沉淀剂乙醇等有机溶剂能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na+等离子能够与这些带电基团结合，核酸与钠、钾、镁形成的盐，在许多种有机溶剂中不溶解。优点通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液；重新调节核酸在溶液中的浓度；可去除溶液中某些盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸。1）乙醇沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，它对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的痕量乙醇易蒸发去除，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品体积的无水乙醇可有效沉淀DNA，

对于RNA则需要将乙醇量增至2.5倍样品体积。2）异丙醇

0.5-1.0倍样品体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5SrRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。优点：所需体积小且速度快，适用于浓度低、而体积大DNA样品的沉淀。缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；DNA沉淀中的异丙醇难以除去（可用70％的乙醇漂洗DNA沉淀）。3）聚乙二醇可用不同浓度的PEG选择沉淀不同分子量的DNA片段。应用6000分子量的PEG进行沉淀时，其使用浓度与DNA片段的大小成反比。除去DNA沉淀中PEG最简便有效的办法是用70％的酒精漂洗2次。4）精胺使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质，与DNA分开。要求在溶液中无盐或低盐（小于0.1mol/L）。用70％的乙醇漂洗沉淀或透析，可去除DNA沉淀中的痕量精胺。2.盐类大多数金属盐都能在短时间内与核酸形成沉淀。使用最多的是1价阳离子，包括钠、钾、铵和锂等离子，但2价镁离子的沉淀效力最高。醋酸钠（NaAc）为沉淀核酸的最常用的盐类，终浓度为0.3mol/L（pH5.2）。醋酸钾（KAc）使用浓度、沉淀效果与NaAc相同，但核酸的钾盐形式很难溶于含SDS（十二烷基硫酸钠）的溶液。氯化锂（LiCl）0.8mol/L终浓度的LiCl不与DNA共沉淀，但可直接沉淀大分子量的RNA，故常应用于RNA的沉淀。氯化钠对于含SDS的DNA，最好用NaCl沉淀，终浓度为0.2mol/L；SDS在70％的乙醇中保持溶解状态，在乙醇漂洗时除去。醋酸铵dNTP在醋酸铵盐溶液中具有较高的溶解度，乙醇沉沉DNA中，加入一定浓度的醋酸铵，可去除大部分dNTP。（铵盐是T4噬菌体多核苷酸激酶的抑制剂）氯化镁Mg2+是核酸沉淀中的有效离子，当核酸浓度低于0.1μmo1或长度小于100个核苷酸时，加入Mg2+可明显提高核酸的沉淀效率，（镁离子对DNA降解有促进作用，且不利于大分子量的DNA的溶解）3.核酸沉淀的温度与时间在一般条件下的DNA沉淀，使用0℃冰水、10-15分钟足可达到实验的要求。4.离心力与离心时间多数DNA沉淀在4℃、12000×g、离心10分钟即可，浓度低于20ng/ml的的DNA沉淀，上述离心条件也可完成。如DNA片段小于100个核苷酸时，则需要超速离心。对于pg水平的核酸沉淀，则应加入tRNA作为载体进行共沉淀。超速离心每分钟60,000转以上5.核酸沉淀的操作方法（1）乙醇沉淀DNA（7步）1）在DNA溶液中加入1/10容积的醋酸钠，终浓度为0.3mol/L，混匀溶液，对于大片段DNA不能振荡，应轻轻反复翻动离心管混匀。2）加入2倍体积的冰冷无水乙醇，

混匀后置于冰上15-30分钟，让DNA沉淀。3）4℃、12000×g、离心10分钟，使DNA沉于管底。

当样品浓度小于20ng/ml或DNA片段小于100bp时，需加大离心力和延长离心时间。4）45度角斜拿离心管，用移液枪从沉淀的对面紧贴管壁处轻轻吸出乙醇。5）加入70％的乙醇至管2/3体积，混匀漂洗以去除残余的盐，4℃、12000×g、离心2分钟，吸去乙醇。重复该步骤漂洗一次。6）敞盖于室温中10-15分钟干燥DNA至没有明显乙醇痕迹且DNA沉淀块大部分变为半透明状。7）用适当体积的TE（pH8.0）或10mmol/L的Tris-Cl溶液溶解DNA沉淀，

37℃-65℃水浴有助于DNA溶解。

DNA一般不溶解在纯水中，因为容易断裂。（2）乙醇沉淀RNA在终浓度为0.8mol/L的LiCl

或0.3mol/L的NaAc或5mol/L的NH4Ac存在的条件下，加入2.5-3.0倍容积的无水乙醇可沉淀RNA，但加入RNA溶液中的盐溶液和乙醇必须无RNase，操作时要防止RNase污染。（四）核酸的定量1.比色法测定核酸浓度1）基本原理组成核酸的4种碱基均具有一定的吸收紫外线特性，由多种核苷酸组成的核酸的最大吸收波长260nm，吸收低谷在230nm，该特性可用来测定核酸溶液浓度。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml，

单链DNA或RNA为40μg/ml，

单链寡聚核苷酸为20-40μg/ml，可以此来计算核酸样品的浓度。分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可初步分析核酸的纯度。测定260nm和280nm紫外线处吸收值的比值（A260/A280）纯品DNA的A260/A280值为1.8，纯品RNA的A260/A280值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明DNA中的RNA未除尽。酚和蛋白质污染将导致比值降低，270nm处有高吸收表明有酚的干扰。既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值也可能为1.8。751分光光度计2）操作步骤a.吸取一定体积DNA样品或RNA样品，

加水稀释一定倍数（一般为20-1000倍），

转入分光光度计的石英比色杯中。b.用水校正分光光度计的零点（空白）。c.在260nm和280nm处分别读取并记录光密度的OD值。d.计算核酸浓度并判断质量。

双链DNA的浓度=OD260×50×核酸稀释倍数；RNA或单链DNA的浓度=OD260×40×核酸稀释倍数；机器合成的短链PCR引物的浓度=OD260×33×核酸稀释倍数。（单位：μg/ml）2.凝胶电泳法测定核酸浓度1）基本原理DNA、RNA本身不产生荧光，荧光染料溴乙锭（EB）插入碱基平面后，核酸样品在紫外线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列不同浓度（已知）DNA溶液作标准对照，可粗略比较出被测DNA溶液的浓度。溴乙锭荧光法一般与核酸电泳分析相结合进行。2）操作步骤a.取一定量的DNA样品（一般为1-5μl），加上1-2μl电泳上样缓冲液（含溴酚蓝），混匀后点样至含0.5μg/ml溴乙锭的小型琼脂糖凝胶的点样孔中。在样品泳道的旁边同时点上1至数个已知浓度的标准DNA样品

（一般为DNAMarker）。b.电泳：凝胶孔一端朝向阴（黑线电极），无孔一端朝向阳极（红线电极），在一定电压下电泳一定时间，核酸由阴极度向阳极迁移，至溴酚蓝迁移至凝胶的一半距离为止。c.将凝胶浸入含0.01mol/L的MgCl2的电泳缓冲液中5分钟，进行背景脱色。d.用短波紫外线（254nm）进行拍照，比较样品DNA与Marker的荧光强度，确定样品中DNA浓度。同时根据带型分析核酸的完整度和纯度。比色法与电泳法的比较比色法的优点可以对核酸的浓度和纯度准确进行量化分析，测定时一般不需要同时提供标准核酸样品作对照，样品测定后回收较方便。比色法的缺点不能直观观察到核酸分子量的带型分布特征、核酸的完整性（降解程度）及杂质核酸的污染程度。电泳法的优点直观可见，可根据核酸的电泳带型分析核酸分子的完整性，杂质核酸的污染情况，

直观比较各带型核酸的浓度。电泳法的缺点亮度与含量的相关性，低浓度下正相关，高于一定浓度严重偏离正相关；溴乙锭嵌入碱基中的多少与DNA的超螺旋程度密切相关；亮度受其它影响荧光发光污染物的影响，因此该法的准确度较差。对于较重要的核酸定量分析，一般采用比色法与是电泳法二者结合，同时进行，综合分析。（五）核酸的保存1.DNA的保存DNA与RNA样品贮存条件各异，对于DNA来说，最好是溶于TE中，TE中的EDTA可螯合金属2价离子，抑制DNA酶的活性。TE的pH值为8，可减少DNA的脱氨反应，并增加DNA的溶解度。短时间保存可放于4℃冷藏室，一般的长期保存只需放于-20℃，-70℃下DNA能保存5年以上。2.RNA的保存RNA酶极不易失活，RNA极易污染RNA酶而被降解。RNA溶可溶于0.3mol/L的醋酸钠（pH5.2）

或无RNase的双蒸消毒水（最好是Millipore级别的水）中，贮放于-70℃以下的超低温冰箱中。RNA的长期保存，以沉淀形式贮存于乙醇中，在-20℃至-80℃的情况下，非常安全；或在RNA溶液中

加1滴

0.2mol/L的VRC（氧钒核糖核苷复合物）（抑制RNase），

-70℃，可保存数年。无论是DNA还是RNA，均宜于分成若干小份，

反复冻融易导致核酸的降解。二、电泳（一）凝胶电泳琼脂糖或聚丙稀酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该方法简单、快速，可直接用低浓度的溴化乙锭进行染色，以确定DNA在凝胶中的位置。1～10ng的DNA就可以检测出。琼脂糖和聚丙稀酰胺凝胶可以制备成各种形状、大小和孔隙度，并在各种装置中进行电泳。聚丙稀酰胺凝胶的分辨率可以达到1bp。一般在垂直装置下使用。琼脂糖凝胶电泳的分辨率不如聚丙稀酰胺凝胶，但其分离范围较广。一般在水平装置下使用。1、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线性高聚物，其基本结构为：将琼脂糖根据所需浓度，按比例加入到所用缓冲液中熔化成清澈、透明的液体，到入胶模中，冷却凝固后，放入电场中。在中性pH中，核酸将从负极向正极迁移。琼脂糖凝胶的制备及电泳（11步）1）根据所需浓度称取一定量的琼脂糖，加入所需体积的1×TAE或TBE电泳缓冲液。2）微波炉加热使琼脂糖溶解。3）溶液冷至60℃时，加入溴乙锭至终浓度为0.5μg/ml。（戴手套操作）4)用医用胶布封好制胶模具，有的模具勿需人工封闭。5)将琼脂糖倒入模具，并在一端安插上梳子，并消除气泡。6）室温下20-45分钟至完全凝固，

低熔点凝胶应于4℃凝固，

小心取出梳子和橡皮膏，将载有凝胶的载胶板放于电泳槽中。7）加入电泳缓冲液（与化胶时一致），让液面高于胶面1mm。8）在DNA样品中加入1/6体积的上样缓冲液，混匀。9）用移液枪将DNA样品小心加入样品孔中。10）接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，切记DNA样品往正极泳动。电压降选择为1-5V/cm。11）根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳，切断电源后，再取出凝胶。含EB的凝胶直接于紫外线灯下观察结果或拍照记录。琼脂糖凝胶电泳的注意事项1）上样要慢而稳，枪头不要碰坏凝胶孔，加样中要完全排出孔中的气泡；2）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、样品孔大小和胶的浓度。

超量上样会导致带型拖尾，轮廓不清。3）每孔不要上样过满，否则会导致样品溢出和孔间交叉污染。4）每样均更换一次性枪头，避免交叉污染。拖尾5）电源接通前应该核实凝胶的方向是否放置正确。6）电泳时两极金属丝上均有气泡产生，阴极的气泡应比阳极的气泡多一倍，几分钟后可见到溴酚兰向阳极移动；7）电泳过程中，溴乙锭向负极移动，与DNA的泳动方问相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中EB含量很低，对于小分子DNA片段检测困难。解决方法是溴酚蓝刚迁移至一半距离时停止电泳。8）EB导致DNA迁移速度下降并影响DNA带型的整齐，较好的方法是在电泳后进行EB染色。1242、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegel electrophoresis，简称PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。•PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的 制备，还可测定分子量、等电点等。1251）聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理聚丙烯酰胶凝胶电泳可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别分离物质。这种介质既具有分子筛效应，又具备静电效应，所以分辨力高于琼脂糖凝胶电泳，具备分离只相差1个核苷酸的不同DNA片段的特性。丙烯酰胺单体（Acr）在催化剂N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的存在下产生聚合反应，形成长链；加入交联剂N，N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis）后，聚丙烯酰胺链交叉连接而形成凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶常规灌制于两块封闭的平板之间，

（氧能抑制丙烯酰胺的聚合反应）然后进行垂直电泳。2）聚丙烯酰胺凝胶电泳优点（与琼脂糖比较）1）分辨率极高，即使最大的片段比最小的片段长500倍，也能很好地分离；2）载样量大；3）回收的DNA样品纯度极高，可用于要求非常严格的实验；4）在凝胶的交联网状结构中，

带有酰胺侧链的C-C聚合物，不带或少带离子侧链基团。5）聚丙烯酰胺凝胶无色透明，比琼脂糖凝胶的紫外线吸收低，

抗腐蚀性强，机械强度高，韧性好。3.聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本步骤（12步）凝胶一般制成0.5-2mm厚度，过厚因产热而导致带型不整；丙烯酰胺是一种神经毒素，操作时应小心，需戴手套和面罩。1）灌胶玻璃板的安装与闭封。2）根据模具体积计算所需配制胶液的容积。3）向丙烯酰胺混合液中加入TEMED、AP，混匀后用注射器灌胶。4）立即插入适当的梳子。5）室温聚合1小时至凝固。6）小心取出梳子，立即用水冲洗孔格，将模具底部的胶带撕去。7）将凝胶放入电泳槽，用夹子固定夹板。8）在上、下两槽中灌好1×TBE溶液。9）将DNA样品与适当的6倍上样液混合，

用微量玻璃注射器上样。

10）接通电源，正极输出与下层贮液槽连接，电压降一般为1-8V/cm。

11）根据指示剂迁移距离判定电泳是否应中止。

停止电泳后，取出玻璃模具，拆去胶带、上玻板和两侧垫条。

12）检测

方法有溴乙锭染色后紫外线观察、干胶后放射自显影或银染。3、SDS-凝胶电泳原理1）

聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠 (sodiumdodecylsulphate)SDS，蛋白电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。2）

加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白的二硫键 还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成蛋白-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于蛋白分子量。3）分离测定：4）

测分子量(与标准蛋白比较)5）鉴定样品纯度(条带数目)6）测定样品蛋白含量：扫描定量(比色)凝胶电泳的操作要点凝胶制备电极缓冲液样品处理及加样电泳染色与固定脱色分析1334、等电点聚焦电泳电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。蛋白进入时，不同的蛋白移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白得以分离。优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定蛋白或多肽的等电点。缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白。134（二）双向电泳是等电聚焦电泳和SDS的组合，即先进行等电聚焦电泳，再进行SDS（按分子质量大小进行分离），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。双向电泳可鉴别出异常的蛋白质，根据其氨基酸序列可追踪相应的突变基础。135（三）毛细管电泳是Jorgenson