第五章-荧光分析法-scf

本章学习目标：1、掌握分子荧光分析法的基本原理和特点

2、掌握荧光与分子结构的关系以及影响荧光强度的因素

3

、熟悉荧光定量分析方法及荧光分光光度计

4、了解分子荧光分析法的应用第05章荧光分析法1处于基态的分子吸收能量后，跃迁到激发态，当激发态分子以发射光的形式释放能量，返回基态的过程，称为分子发光。

一、什么是分子发光？

分子荧光分析法2

二、分子发光的分类(按激发的模式

)分子发光热致发光光致发光场致发光化学发光荧光☆磷光分子荧光分析法3分子荧光分析法优点：灵敏度高；选择性好；试样用量少；方法简单。光致发光：物质分子吸收电磁辐射能后，将从基态跃迁到激发态，处于激发态的分子发射出光的现象，称为光致发光。最常见形式是荧光和磷光。荧光分析法：根据物质的荧光光谱的特征及强度对物质进行定性和定量分析的方法，称之为荧光分析法。4第一节分子荧光分析法的基本原理（重点）一、分子荧光的产生单重态（S）：s=0，M=1，分子所处的电子能态。三重态（T）：s=1，M=3，分子所处的电子能态。1.分子的电子能级和激发过程分子电子能级的多重性：总自旋量子数：E自旋量子数：s=½或-½

泡利不相容原理52.荧光的产生

在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4

~1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。电子能级的多重性：M=2s+1，s（总自旋量子数）6根据波兹曼分布，分子室温基本处于电子能级的基态，激发时，基态电子只能跃迁到激发单重态，不能直接跃迁到激发三重态（根据自旋禁阻定律）。电子处于激发态（不稳定状态），可通过无辐射跃迁和辐射跃迁(发光)等方式失去能量，返回基态。2.荧光的产生能量传递途径辐射跃迁荧光磷光系间窜跃无辐射跃迁振动弛豫内转换外转换7

在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以无辐射形式放出的过程。（1）振动弛豫无辐射方式传递途径振动弛豫时间:10-12秒数量级8

当两个电子激发态之间的能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射方式转移至低能级的过程。如右图，处于高激发态（S2）的电子，通过内转换，转移到低激发态（S1）的振动能级。（2）内转换9

激发分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。外转换使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。（3）外转换10

处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。如图，电子S1的振动能级同T1的振动能级重叠，则可能发生体系间跨越S1→T1

，分子由激发单重态跨越到激发三重态，荧光强度减弱甚至熄灭。（4）系间窜跃11

物质分子吸收能量被激发后，从激发单重态的最低振动能级返回基态时发射出的光，称为荧光。注意：无论电子开始被激发至哪一个激发单重态，经过振动弛豫及内转换，均可回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光而返回至基态各振动能级上。

荧光的产生在10-7-10-9s内完成。

（1）发射荧光辐射方式传递途径12

电子由第一激发单重态的最低振动能级，以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经三重态最低振动能级返回至基态时发射的光，称为磷光。由于（T1→S0）这个跃迁过程也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-4-10s。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。（2）发射磷光13

荧光和磷光产生示意图S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫14二、激发光谱与荧光光谱激发光谱（excitationspectrum）：使不同激发波长的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固定发射波长的单色器而照到检测器上，测定不同激发波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光谱。注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。15二、激发光谱与荧光光谱16荧光光谱（fluorecencespectrum）：固定激发光波长（为最大激发波长）和强度，而让荧光物质发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同发射光波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。荧光物质的最大激发波长（ex）和最大发射波长（em）是鉴定物质的根据；也是定量测定最为灵敏的条件。17B.发射光谱(荧光光谱)固定激发波长扫描发射波长C.激发光谱与发射光谱的镜像关系S04321S14321发射光谱的形状与激发波长无关：分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)1→

41→

31→

21→11

→11

→21

→31

→4181.斯托克斯位移(Stokesshift):荧光发射波长总是大于激发光谱波长的现象。室温下菲的乙醇溶液荧光光谱荧光光谱的特征（重点）192.荧光光谱与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一电子激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状与激发波长无关。3.荧光光谱与激发光谱的镜像关系激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。20nm200280360440520020406080100Fab4b3b2b1b0c0c1c2c3c4蒽的激发光谱（虚线）荧光光谱（实线）蒽的能级跃迁V=0V=1V=2V=3V=4V=0V=1V=2V=3V=4b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4∆E4∆E3∆E2∆E1∆E4∆E3∆E2∆E121（一）分子产生荧光必须具备两个条件：三、荧光强度与分子结构的关系分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；②吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。22荧光效率（fluorescenceefficiency):指激发态分子发射荧光的量子数与基态分子吸收激发光的量子数之比，常用表示。2324

（重点）252627282930三、影响荧光强度的外部因素1、温度2、溶剂：极性、粘度3、酸度：荧光物质自身最适宜的pH范围4、荧光熄灭剂：主要四种类型5、散射光：瑞利光、拉曼光31五、影响荧光强度的外部因素温度降低，荧光效率和荧光强度升高。1）温度2）溶剂随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π*跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低；溶剂应达到足够的纯度。323）pH值具酸或碱性基团的荧光物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。荧光物质都自身最适宜的pH范围。NH3+OH-H+NH2NH-OH-H+33荧光淬灭（荧光熄灭）：荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光淬灭。荧光淬灭剂：能引起荧光熄灭的物质。4)荧光淬灭碰撞淬灭M+hv→M*,M*+Q→

M+热静态淬灭M+Q→

MQ

非荧光物质转入三重态的淬灭三重态，氧的作用荧光物质的自淬灭荧光物质浓度较高导致荧光淬灭的四种原因：34荧光淬灭法:

荧光物质加入某种淬灭剂后，其荧光强度的减少与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，可用于测定熄灭剂的含量，这种方法称为荧光淬灭法。355)散射光瑞利散射光(Rayleighscatteringlight)：光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，运动方向改变；λ瑞利光＝λ入射光拉曼散射光(Ramanscatteringlight)：光子与物质分子发生非弹性碰撞，发生能量交换，运动方向改变；λ拉曼光≠λ入射光消除方法：选择适当的激发波长36320360448激发

320nm硫酸奎宁350448激发

350nm硫酸奎宁320360激发

320nm0.1mol/L硫酸350400激发

350nm0.1mol/L硫酸a.强度b.强度硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光（a）与拉曼光谱（b）372、定量方法

1、定量依据

第二节荧光定量分析方法38

优点

1.灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；检测下限：0.1～0.001g/mL2.选择性强既可依据发射光谱特征，又可根据激发光谱特征；

3.试样量少和方法简单

缺点应用范围小391、定量依据

荧光强度

If

正比于吸收的光强度

Ia和荧光量子产率Φ：由朗伯-比耳定律得：荧光强度If

：40对于稀溶液，当2.303bC<0.05时：

If

----荧光强度I0

----入射光强度Φf----荧光量子产率b--吸收光程--摩尔吸光系数C--物质浓度412、定量方法

标准曲线法：FCsFxCx42直接比较法注意：样品与标样溶液浓度接近，在线性范围内步骤：1.配制标准溶液和试样溶液2.测IF3.求浓度43对于荧光法F=2.3kI0ECl

FI0，I0

增强，F增大；低浓度时，FC

只要检测器灵敏，可检测微弱信号。对于分光光度法A=-lgT=ECl

C极小时，A0，无吸收； 若C不变，改变入射光I0强度，A无变化。 所以吸收光谱受一定限制，灵敏度小于荧光光谱。为什么荧光分析法比紫外可见法更灵敏？44

用于测量荧光的仪器由激发光源、样品池、用于选择激发光波长和荧光波长的单色器以及检测器四部分组成。由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。

第三节荧光分光光度计45氙灯氙灯问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？46紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制荧光分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器474849紫外-可见分光光度计

测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池I0ItI0ItIF,p50 在测量分子荧光强度时，要在与入射光成直角的方向上进行测量，这是由于（）A.只有在入射光线成直角的方向上才有荧光B.荧光强度比透射光强度小C.荧光强度比透射光强度大D.荧光波长比透射光波长长E.荧光是向各个方向发射的，为了减小透射光的影响 荧光分光光度计常使用的光源是（）A.空心阴极灯B.氙灯C.氢灯D.硅碳棒BE51仪器的校正（1）灵敏度的校正 一定浓度的稳定荧光物质作对照品溶液调仪器 （如1ug/ml硫酸奎宁）（2）波长校正汞灯的标准谱线（3）激发光谱和荧光光谱的校正光源强度、检测器的感应度52荧光分析法的应用（1）无机化合物的分析采用有机试剂进行荧光分析的元素已近70多种能够与金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物。（分子刚性平面结构增大）另一类络合物是三元离子缔合物。 例：罗丹明B为阳离子荧光染料，Au3+、Ga3+、Tl3+等阳离子首先与卤素离子形成二元络阴离子，再与罗丹明B缔合形成荧光化合物。荧光猝灭法也是常采用的方法。53脂肪族有机化合物本身能发荧光的很少，需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光，可直接用荧光法测定。对具有致癌活性的多环芳烃，荧光分析法已成为最主要的测定方法。在生物化学分析、生理医学研究和临床、药物分析领域，许多重要的分析对象，如维生素、氨基酸和蛋白质、胺类、甾族化合物、酶和辅酶等，均可用荧光法分析。（2）有机化合物的分析54荧光分