显微操作技术

显微操作技术

生命科学学院

杨东

QQ1034683507第1章显微技术发展历史1.1.1生物学显微技术的概念:

是基于生物学理论知识,以生物体为材料,在光学显微镜观察的范围内所开展进行的实验操作技术.1.1.2显微镜的发明史★十六世纪的显微镜★十七世纪显微镜镜★十八世纪的显微镜★十九世纪的显微镜★二十世纪的显微镜★未来的显微镜

“昨天，今天和明天”十六世纪的显微科学

十六世纪单式显微镜十六世纪复式显微镜

第一个复式显微镜:詹森显微镜十七世纪的显微科学

单式显微镜的发展

单式显微镜有一个致命的缺点,它的焦距与透镜直径成正比,与放大倍数成反比。也就是说,焦距越短,放大倍数越大,而透镜直径又越小。如果放大倍数是100倍,透镜的焦距为0.25毫米,透镜直径大约为0.33毫米。这个比大头针头还小的透镜在当时根本制造不出来。因此,当时的放大镜的放大倍数最多不过25倍。列文虎克和他的显微镜（约1680）

单式显微镜的顶峰----列文虎克的显微镜

AntonivanLeeuwenhoek(1632-1723)荷兰代尔夫特人，是生物学发展史上的一位重要人物，一位仅仅受过初级教育的天才科学家和显微镜制造者。他一生亲自磨制了550个透镜，装配了247架显微镜，为人类创造了一批宝贵的财富，至今保留下来的有9架。他最先发现了细菌，从而开创了微生物学。

复式显微镜在性能上明显优于单式显微镜。一是它的放大率可以做得很高,可以把几个放大倍数较小的凸透镜组合起来获得很高的放大率。二是制造工艺较简单,不必磨制一个个极小的透镜。复式显微镜的发明,是科学史上的里程碑,人类从此开始认识微观世界。

伽利略的显微镜胡克的显微镜十八世纪的显微科学

十八世纪是欧洲科学复苏的时期,各种新的科学理论层出不穷。由于不被人十分重视,十八世纪的复式显微镜发展很慢,但仍然做出了一些漂亮的显微镜。这类显微镜的特色在于:

(1)新式底座。

(2)独特镜臂结构。

(3)当时最先进的聚光方法。

卡夫(Cuff)显微镜

Cuff显微镜的功能在当时是最多的.它有三种性能:透射观察,落射观察和活体观察.其中,活体观察功能是在当时复式显微镜中特有的。

Cuff显微镜是当时最好的复式显微镜.

Cuff-Style显微镜Wales显微镜Chest显微镜

历史上最豪华的显微镜:英王GeorgeIII的银显微镜。十九世纪的显微科学

十九世纪，随着工业革命的进行，显微科学也同其它学科一起飞速发展起来。其主要的原因是机械的使用使透镜的质量大大提高和光学的发展使显微镜的结构更加符合光学原理。Ladd的学生显微镜

英国人WilliamLadd在1864年制造，采用了当时最先进的齿轮调焦装置

这个显微镜的镜臂上多出了一个在前几个世纪的显微镜上都看不到的东西----聚光镜

十九世纪的显微镜是今天光学显微镜的雏形wenham显微镜由英国伦敦人FrancisWenham在1882年制造。有着当时最为精巧先进的齿轮传动系统和齿轮调焦系统,聚光系统还有成像系统。是十九世纪中性能最好的显微镜,也是历史上最精美的显微镜。Nachet偏振光显微镜

最早消除色差的显微镜之一最早的偏振光显微镜之一二十世纪的显微科学

由于人们在物理，数学和材料科学等领域取得了非常大的进展，显微镜的质量大大提高。各种新型的显微镜也应运而生。各种新技术也相继出现。数字成像技术开始了用计算机来处理传送显微影象的时代，使人们记录显微影象的方式又前进了一步。1.明场显微镜2.暗场显微镜3.相衬显微镜4.偏光显微镜5.干涉显微镜6.紫外显微镜7.荧光显微镜8.体式显微镜荧光显微镜

利用强烈的经过虑光器过滤的激发光线（紫外光或蓝紫光）激发标本（经过荧光染色或没有）产生荧光进行观察的一种显微镜。优点：成像对比强烈，色彩鲜艳，分辨率高，可以观察到一般不可见的物质（如DNA等分子）的分布情况等。现广泛用于免疫荧光技术和基因芯片技术。另一种荧光显微镜偏光显微镜万能研究显微镜功能繁多：有明视野，暗视野，相差，偏振，微分干涉，荧光，显微摄影等等，有的还具有显微操作的功能。是一种高档次的显微镜。万能研究显微镜

laserconfocalscanningmicroscope,LCSM未来显微镜的发展一、拍得更清晰二、放大倍数更高三、更为人性化的设计四、一体化的显微镜五、专门的网络化显微镜六、光源的革新

一、拍得更清晰显微镜厂商为此开发出各种各样的显微镜镜头来消除各种色差和场曲。最近，在显微镜上普遍采用了UIS2光学系统，它充分体现了无限远校正方式的优越性。UIS2无限远光学系统的物镜具有在宽波长范围内（由紫外至近红外区）具有一致的高透过率。同时具有更高的信噪比，不需要额外补偿就可以得到更为清晰的图像。二、放大倍数更高通常情况下，目镜的放大倍数为10倍或者16倍。以40倍物镜为例，也不过是放大400倍或者是640倍，如今却能够将放大倍数提高到840倍。例如美国AMG公司开发的倒置显微镜，在物镜下采用了21倍的光学放大，使得我们能够通过40倍的物镜就可以观察到放大倍数更高的图像了。如果换成100倍的油镜，就可以通过显示器观察到放大到惊人的2100倍甚至更高的图像，无不让人赞叹技术的发展之快。

三、更为人性化的设计

四、一体化的显微镜

也许现在我们接触到的显微镜大多是机械式的，需要手动来调焦距、调光源、调样品的位置，特别是针对细胞培养，出现了大量连续培养过程中显微观察的要求。为此，各个显微镜厂商设计了能够用于连续培养显微观察的显微镜或配件五、专门的网络化显微镜Nikon公司的Coolscope和Leica公司的DMD108为临床远程病理会诊提供了方便，它们专门为载玻片显微观察设计，自动转换物镜，自动对焦，得到的图像可直接通过网络发送到异地进行专家会诊。六、光源的革新

对于荧光显微镜，到现在为止绝大多数显微镜还在使用卤钨灯或者是高压汞灯，一方面这类光源使用寿命短，需要3到4各月更换一次，每次更换后都需要专业工程师进行位置校准；另外一方面，这类光源的强度会随着使用寿命而衰减；还有一方面，这类光源对于显微镜操作来说需要预热来等待光源强度稳定，而且光源关闭后需要等待30分钟左右才能重启.

总观光学显微科学四百多年的历史,显微科学也得到了飞速发展。我们可以看到,任何一个学科的发展都离不开其它学科的支持。1.2显微解剖切片机发展史“切出精彩”生物切片机已发展成为五大系列上百个品种,即①旋转式切片机

、②滑行式切片机

、③冰冻切片机、④振动切片机、⑤超薄切片机。

1.3染色技术发展史1.3.1显微技术的用具及其方法演进载玻片

盖玻片染色缸1.3.2染色技术发展史

天然染料人工染料

单染双重染色三重染色四重染色

第2章显微镜及其附加设备一．显微镜的光学性能

透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。依其外形的不同，可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类。

三．影响成像的关键因素—相差

由于客观条件，任何光学系统都不能生成理论上理想的象，各种象差的存在影响了成像质量。下面分别简要介绍各种相差。

1．色差（Chromaticaberration）

色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在多色光为光源的情况下，单色光不产生色差。白光由红橙黄绿青蓝紫七种组成，各种光的波长不同，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在象方则可能形成一个色斑。

色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置观察，都带有色斑或晕环，使像模糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘

色差(Chromaticaberration)P图示：色差的产生图示：色差的消除

PP’n1n22.球差(Sphericalaberration)由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，若原光束不同孔径角的各光线，不能交于主轴上的同一位置，以至在主轴上的理想像平面处，形成一弥散光斑（俗称模糊圈），则此光学系统的成像误差称为球差。

球差造成的结果是，一个点成像后，不在是个亮点，而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑。

球差(Sphericalaberration)轴上物点发出的大孔径光线不聚焦于一点PP

球差的矫正常利用透镜组合来消除，由于凸、凹透镜的球差是相反的，可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。

3.慧差：

由位于主轴外的某一轴外物点，向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，若在理想像平面处不能结成清晰点，而是结成拖着明亮尾巴的慧星形光斑，则此光学系统的成像误差称为慧差。慧差(Coma)

图示：慧差的产生靠近光轴的物点发出的大孔径光线不聚焦于一点

PXY慧尾形的弥散像图示：不同大小慧差的照片慧差的校正：

复合透镜；

加光阑；不晕点---同时消除了球差和慧差的一对共轭点

非球面透镜；4．像散（Astigmatism）

像散也是影响清晰度的轴外点单色相差。当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起像散。像散使原来的物点在成象后变成两个分离并且相互垂直的短线，在理想象平面上综合后，形成一个椭圆形的斑点。像散是通过复杂的透镜组合来消除。

造成光学系统出现轴上像散的主要原因有两个一是光学面有较大的偏心，二是光学面变形。消除方法：通过复杂的透镜组合来消除5．场曲（Curvatureoffield）

场曲又称“象场弯曲”。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想象点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的象点，但整个象平面则是一个曲面。这样在镜检时不能同时看清整个相面，给观察和照相造成困难。因此研究用显微镜的物镜一般都是平场物镜，这种物镜已经矫正了场曲。

图示：场曲的产生物平面对应的子午面、弧矢面、最小弥散圆平面为曲面场曲与像散结伴而生6．畸变（Distortion）

前面所说各种相差除场曲外，都影响象的清晰度。畸变是另一种性质的相差，光束的同心性不受到破坏。因此，不影响象的清晰度，但使象与原物体比，在形状上造成失真。畸变(Distortion)物平面 枕形畸变 桶形畸变畸变成像：枕形畸变是由于视场边缘部分的放大率高于中心部分放大率所引起桶形畸变是由于视场边缘的放大率比中心部分低所引起的

像差球差象散慧差场曲负畸变正畸变光学显微镜基本结构：1.照明灯(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.载物台和切片夹(Mechanicalstageandspecimenretainer)4.推进器(Mechanicalstageadjustmentknob)5.物镜(Objectives)6.粗细螺旋(Courseandfinefocusknob)7.目镜(Oculars)8.照相机等接口(Connectiontocamera,etc.)数值孔径N.A（n.sin）数值孔径的大小代表了光镜的会聚能力。数值孔径越高，光镜的分辨力越大，所呈影像的亮度越强。（一）数值孔径

数值孔径简写：NA，数值孔径是决定物镜性能的非常重要的参数它是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。它是一个比物镜的焦距更加实用的特性.任何设计良好的物镜孔径将能够表示:1.在多远的给定焦距可以看清标本中的细微结构2.当孔径充满时可以通过物镜的光量

孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。

显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理，就产生了水浸系物镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于一，NA值就能大于一。

以空气为介质（干燥系）的物镜的NA值多在0.05-0.95之间。空气的折射率为n=1，二孔径角最大不能超过180度，否则会因为物镜工作距离等于零而无法工作。Sin(180/2)=1，所以空气介质的NA值小于1。用高倍显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法进一步增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于1，NA值就能大于1。水的折射率为1.333，水浸系物镜的NA值最大可达到1.25。香柏油的折射率为1.515左右，因此一般油浸物镜的数值孔径最大值（NA值）为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，高级物镜用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。

（二）分辨率

显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称“鉴别率”。其计算公式是：分辨率Z=0.61*λ/N.A

式中为Z最小分辨率距离；为λ光线的波长；NA为物镜的数值径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则值越小，分辨率就越高.提高分辨率的效果要提高分辨率，即减少值，可采取以下措施（1）降低波长λ值，使用短波长光源（2）增加介质值以提高NA值（3）增加孔径角值以提高NA值（4）增加明暗反差（三）放大率

放大率和有效放大率：由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率Γ应该是物镜放大率β和目镜放大率Γ1的乘积：Γ=βΓ1显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念

有关系式：500NA<1000NA当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以放大镜原理为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。

根据：总放大率=物距/物镜焦距×相距（250mm）/目镜焦距；增大物距—即镜筒长度，可以提高放大率，但是镜筒不能无限拉长，通常国际标准长度为160mm。（四）焦深

焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其它技术参数有以下关系：

1．焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比。

2．焦深大，分辨率降低

（五）镜像亮度

镜像亮度是指显微镜观察中的图像明暗程度。一般镜检中，镜像亮度要求使眼镜既不感到暗淡，又不耀眼为好。显微镜的镜像亮度与放大倍数有什么关系？物镜的NA值大，镜像的亮度越大，总的放大倍数越高。焦点深度（六）视场亮度

视场亮度是指显微镜所观察的整个视场（或视野）明暗程度，视场亮度不仅仅与物镜，目镜有关，也与聚光镜、视场光阑和光源有关。在不更换物镜和目镜的情况下，视场亮度增大，镜像亮度也增大。（七）视场直径

视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径23最为科学，大视场容易引起场曲。F=FN/M;F:视场直径，FN：视场数，M:物镜放大率。视场数（FieldNumber,简写为FN），标刻在目镜的镜筒外侧。由公式可看出：

1．视场直径与视场数成正比。

2．增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。

不同目镜的视场直径(八)盖玻片校正

由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。(九)工作距离工作距离是指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离.工作距离短,物镜的孔径角则大.换而言之,数值孔径大的高倍镜,其工作距离小.焦点：决定图像是模糊还是清晰？焦点与焦距有关，且可以通过聚焦旋钮控制。样本载波片上的盖片厚度也会影响图像对焦——盖片对物镜而言可能太厚。正确的盖片厚度应标注在物镜的侧面。花粉粒对焦（左图）和失焦（右图）时的显微镜图像分辨率：图像中的两个像素达到多近的间距时会分辨不清？分辨率与物镜的数值孔径（数值孔径越大，分辨率越高）以及通过透镜的光线波长（波长越短，分辨率越好）有关。花粉粒的高分辨率（左图）和低分辨率（右图）显微镜图像调节不同参数产生的效果亮度：表示图像有多明亮？亮度与照明系统相关，因而可以通过改变灯的电压/电阻器，以及调节聚光器和光圈/针孔孔径进行更改。此外，亮度还与物镜的数值孔径有关（数值孔径越大，图像越明亮）。花粉粒在高亮度（左图）和低亮度（右图）情况下的显微镜图像对比度：样本周围区域的光照差别怎样？对比度与照明系统相关，可以通过改变光线强度以及光圈/针孔孔径对其进行调节。除此之外，对样本进行化学着色也可以增强对比度。花粉粒在高对比度（左）和低对比度（右）情况下的显微镜图像三.显微镜的构造

显微镜的基本构造包括两大部分,光学系统和机械系统,机械系统有镜座,镜柱,镜壁,镜筒,物镜转换器,载物台,调焦螺旋,聚光器调节螺旋.光学系统有物镜,目镜,反光镜,聚光器,虹彩光圈.1.物镜

齐焦性能和合轴程度齐焦性能是反映某一倍率的物镜观察图象清晰后,在转换至另一倍率的物镜时,其成像亦应基本清晰,而且物镜光路也基本合轴,中心不偏离.根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：①干燥系物镜以空气为介质，常用的40×以下的物镜，数值孔径均小于1。②水浸系物镜③油浸系物镜根据物镜放大率的高低，可分为：①低倍物镜指1×—6×，NA值为0.04—0.15；②中倍物镜指6×—25×，NA值为0.15—0.40；③高倍物镜指25×—63×，NA值为0.35—0.95；④油浸物镜指90×—100×，NA值为1.25—1.40。

物镜结构根据物镜像差校正的程度来分类可分为：①消色差物镜是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和蓝光形成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。②复消色差物镜物镜外壳上标有“Apo”字样，除能校正红、蓝、绿三色光的色差外，还能校正红、蓝色光造成的球差，通常与补偿目镜配合使用。③半复消色差物镜

④平场物镜是在物镜的透镜系统中增加一快半月形的厚透镜，以达到校正场曲的缺陷，提高视场边缘成像质量的目的。对于平视场消色差物镜，其倍率色差不大，不必用特殊目镜补偿。而平视场复消色差物镜，则必须用目镜来补偿它的倍率色差。⑤特种物镜在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如：带校正环物镜，带视场光阑物镜，相差物镜，荧光物镜，无应变物镜，无罩物镜，长工作距离物镜等。

2.目镜

目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。

1.惠更斯目镜眼点教低3mm2.冉姆斯目镜眼点较高12mm3.凯尔勒目镜4.补偿目镜不能与数值孔径低于0.65的物镜配合使用5.平场目镜

3.聚光镜聚光镜又名聚光器，装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。1.集光器的效用收集光源光线并集合将其成束，以增强照明亮度。通常由2-3个凸透镜组成，最上面的透镜面为平面。2.物镜的有效镜口率=（物镜镜口率+集光器镜口率）/21、阿贝聚光镜2、消色差等光程聚光镜3、摇出式聚光镜4、极低倍聚光镜4显微镜的照明装置显微镜的照明法按其照明光束的形式，可分为“透射式照明”和“落射式照明”两大类。透射式照明适用于透明或半透明的被检物体，绝大多数生物显微镜属于此类照明法；落射式照明则适用于非透明的被检物体。透射式照明又可分为中心照明和斜射照明两种形式。中心照明又分为临界照明法和柯勒照明法。

5.物镜4.标本平面3.聚光镜2.聚光透镜

1.光源

8.二次灯像

7.物镜

6.标本平面5.聚光镜4.孔径光阑3.视场光圈2.聚光透镜1.光源

临界照明法柯勒照明法落射式照明1.光源2.聚光透镜3.孔径光阑4.视场光圈5.聚光透镜6.半透膜反射镜7.物镜8.被检物体9.至中间像面光路5显微镜的几种附件1.游标尺游标尺在普通显微镜上常标刻在载物台上的推动器上，研究用显微镜多标刻在载物台的纵横边缘。它的主要作用是：１）可粗放测量被检物的大小或长度；２）提供被检标本的坐标位置。观察被检物体时，如发现其要点，可将纵、横座标刻度记录在案，待以后镜检时，只要按所记刻度进行观察，随即在视场中被找到。2.显微测微尺显微测微尺是用来测量视场中被检物体的大小、长短的工具。包括有目镜测微尺和测微台尺（也称镜台测微尺），用时必须两者互相配合，才能完成其测量功能。3.投影屏和投影目镜4.共览装置左：目镜测微尺下：测微台尺0.01mm

生物光学显微镜的种类倒置显微镜1倒置显微镜的特点1.投射光倒置显微镜的光源和聚光器位于载物台的上方，照明光源自上方向向下照射；2.物镜安装在载物台的下方，向上对焦；3.物镜、聚光镜以及其他光学具组均适用于长焦距观察；4.其一般物镜最大放大率仅限于40X以内，这是因为在光学设计中，无法同时解决大数值孔径和长工作距离的要求；5.在医学生物学领域中适合观察培养瓶中贴壁生长的细胞或浮游于培养液中的细胞物镜补偿环的调节常常遇到不同厚度的瓶壁影响观察效果。为了补偿这一弊端，倒置显微镜的物镜装有补偿环。遇到厚度不同瓶壁影响清晰度时，可调节此环得到最佳反差时为止。一般具有相差物镜，用于观察培养的活细胞。2体视显微镜（Stereomicroscope）其光学结构原理是由一个共用的初级物镜，对物体成像后的两个光束被两组中间物镜亦称变焦镜分开，并组成一定的角度称为体视角（一般为12度--15度），再经各自的目镜成像，它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得，利用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有一定的夹角，为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。特点

1．双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有一定的夹角—体视角（一般为12度---15度），因此成像具有三维立体感；2．像是直立的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把像倒转过来的缘故；3．虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长4．焦深大，便于观察被检物体的全层。5．视场直径大。6.对观察体无需加工制作，直接放入镜头下配合照明即可观察。观察物要求放大倍率一般不大，在200倍以下，常用的在4X-45X之间，以落照射明为主，也可用透射光观察透明物体或半透明物体，或观察物体的轮廓。因物镜与观察体距离较大，可进行镜下操作。应用于微电子行业，医学外科等部门。3、暗视野显微镜应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。(一)原理和结构特点

在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。暗视野显微镜就是利用此原理设计的。丁达尔现象暗视野显微镜是在普通光学显微镜中去除明视野集光器，换上一个暗视野集光器而成。它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡,不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上。明场普通显微镜成像光路图暗场照明光路图标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。成像特点及优缺点在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像,并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构，只能呈现出物体的轮廓而且比实物要大。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于安装暗视野聚光器，即可改装成暗视野显微镜。在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。(二)制作中央遮光板

(1)．将显微镜聚光器调到最高位置，用低倍镜对好焦距。

(2)．取下目镜，从镜筒中观察并调节光阑的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。

(3)．用厚黑纸剪制中央挡光板。外圈直径与滤光片框架相同，中央部分的大小与调节好的光阑孔径一样(可用半透明的小纸片，放在通光孔处聚光镜镜面上，纸上显示的光斑即为光阑的孔径，再用圆规量取大小)。

(4)．将中央挡光板放在滤光片框架上，开大光阑进行样品观察。如需使用高倍镜作暗视野观察，应按高倍镜对焦后的视野大小重新制作中央挡光板。（三）使用方法(1)．把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。

(2)．选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，所以一般用显微镜灯照明。

(3)．在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油，目的是不使照明光线于聚光镜上面进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。

(4)．升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光束的顶点照射被检物。如果聚光器能水平移动并附有中心调节装置，则应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。

(5)．选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，找到所需观察的物像。(6)．观察并记录结果。要求与注意事项(1)制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻片(载玻片厚度约1.O～1.1mm，盖玻片厚度约0.1mm)，否则会影响暗视野集光器斜射光焦点的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。(2)采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物像不清晰。(3)调节光源：使光线集中在暗视野集光器上。先用低倍镜观察，移动暗视野集光器，使其中央的一个圆圈恰好处在视野的中央。如暗视野集光器已准确固定好，则可免去这一步骤。(4)先在暗视野的集光器上加香柏油一滴，然后将标本放在载物台上，把暗视野集光器向上移，使其上的柏木油与标本片的底面接触，中间不能有气泡存在。暗视野显微镜下苍白密螺旋体4相差显微镜原理和结构特点光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。当光波遇到物体时，其波长(颜色)和振幅(亮度)发生变化，于是就能看到物体，当光波通过透明的物体时，虽然物体的内部不同结构会有厚度和折光率不同的差异，而波长和振幅则仍然是不会发生改变的。因此，就不易看清这些不同的结构。用普通光学显微镜观察一些活的微生物或其他细胞等透明物体时，也就不易分清其内部的细微结构。但是，光线通过厚度不同的透明物体时，其相位却会发生改变，形成相差。不过，相差不表现为明暗和颜色的差异，这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。我们可以利用光学的相干干涉原理，可以把相差改变为振幅差，这样就能使透明的、厚度和性质不均匀的结构表现明暗的不同，能够较清楚地予以区别。如果这两条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失，或者相对振幅相互影响而光线减弱。如果一条光波虽然迟滞了一个波长,但两条光波位相相同,则因波的叠加而光线增强-明相差+暗相差相差显微镜，能够通过其复杂的结构，改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差，即明暗差，可以被我们的感觉器官所感知。同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。成像光路图相差显微镜的构造特点相差显微镜的构造以普通显微镜为基础，与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜，并带有一个调节合轴用的望远镜。相差环则是由大小不同的环状孔形成的光阑，放置在光源通路上，使光线只能由环状部分通过，环状光圈的大小可由集光镜的数值口径(N.A)来调节。环状光圈的大小由不同大小的环状孔控制。环状光阑的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。相差环相差物镜是在物镜的后焦点处加一环状相板。相板由光学玻璃制成，安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，具有改变相位的作用。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。放大倍数不同的物镜，其相板也不同。调轴望远镜：是用来进行合铀调节的。使用不同的相差物镜时，应配合相应的环状光圈，并用合轴调节望远镜观察环状光圈和相板，调节至环状光圈的亮环与相板的暗环完全重合。这样，光线通过标本后，就必须经过相板而发生相位的改变，造成明暗差异的影像。要使得聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。环状光圈、相差物镜配合与调节好之后，其他操作方法与普通光学显微镜相同。使用方法（1）相差装置的调换安装卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。

（2）调焦打开光源，旋转集光器转盘，将“0”对准标示孔，使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为40X时应用40X标示孔的光阑。（3）合铀调整拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远镜向内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其上升，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与暗环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合。（4）观察换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。用途位相显微镜是利用样品中质点折射率的不同或质点厚度的不等，产生光线的相位差，使新鲜标本不必染色就可以看到，而且能够观察到活细胞内线粒体及染色体等精细结构，还可以应用于霉菌、细菌、病毒等更微小活体的研究，进行标本形态、数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察，并可进行量度与比较。

用途：观察未经染色的玻片标本

相差显微镜比普通光镜多了2个部件：①在聚光器上增加一个环形光阑；②在物镜后焦面增加一个相板，相板上有一个环形区，通过环形区的光比从其它区域透过的光超前或滞后1／4，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。相差显微镜具有两个其他显微镜所不具有的功能:①将直射的光(视野中背景光)与经物体衍射的光分开;②将大约一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化。

5荧光显微镜(fluorescencemicroscopy)是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。

什么是荧光?物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。荧光（Fluorescence）：

自发荧光：由细胞本身存在的物质经紫外线照射后发出的荧光。诱发荧光：一些细胞成分本身经紫外线照射后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱发荧光。荧光素(fluorochrome)是指一类可以吸收激发光的光能，并能发射荧光的物质．一定的荧光素能和组织（细胞）的某些成分发生特异结合，并在相应部位呈现一定的颜色的荧光．荧光显微镜的基本构造普通荧光显微镜的不足使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61λ/NA）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。6激光扫描共聚焦显微镜焦点模糊

对于有一定厚度的样品（大于2微米），一方面，由于在物镜聚焦平面上下的平面上也有荧光被激发，焦平面上的荧光图像将有一定的模糊，这被称为轴向（Z）干扰；另一方面，感兴趣区域的样品也会受到同一焦平面上邻近区域所激发的荧光的干扰，使得图像的对比度降低，这被称为侧向（XY）干扰。LSCM的工作原理

激光扫描共聚焦显微镜的主要原理是利用激光器发出的激光，透过光源针孔形成点光源,激发光透过激发波长滤片后到达分光镜。由于分光镜能够反射波长较短的激发光，而透过波长较长的发射光，所以激发光在分光镜处被反射，透过物镜，在扫描装置和控制装置的控制下在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描。荧光标记被激发出来的发射光经原来入射光路直接反向回到分光镜，透过分光镜后再通过吸收波长滤片，随后通过探测针孔到达光电倍增管(PMT)经过信号处理，在计算机显示屏上形成图像。

LSCM的主要组成部分照明针孔：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与探测器针孔及焦平面形成共聚焦装置。光束分离器：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。物镜焦平面：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。该光斑经过objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminatingpinhole及detectorpinhole两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。探测器针孔：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。PMT：光电倍增管（探测器）：接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平面的图象。激光器：共聚焦显微镜技术的发展离不开激光器的飞速发展。我们可以根据研究需要选择不同的激光器。多荧光通道：具有多个荧光通道，以实现同时对样品进行多种标记。LSCM与荧光显微镜不同之处在此过程中,由于激光光源的光源针孔和探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,即所谓的“共聚焦”，样品焦平面上的点同时聚焦于光栅针孔和探测针孔，即只有焦平面上的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的不能通过小孔，因此，对样品进行扫描时，扫描点以外的非观察点不会成像，背景呈黑色，样品需经逐点扫描后才形成整个标本的光学切片。激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明，激光光源2.具有照明小孔和探测小孔3.照明小孔和探测小孔共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面4.具有扫描系统——逐点扫描成像5.无损伤、连续光学切片，显微“CT”6.真正的三维重组7.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物第二章光镜标本基本制作技术

生物显微制片有许多不同的方法，一般可分为非切片法与切片法两大类显微制片技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总结经验，才能得到较好的结果。1非切片法

即不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法，根据材料性质的不同，有不同的处理方法，该类方法操作简单快捷，其中铺片法，封藏法可使原有组织结构不被破坏，涂片法，压片法弥补了用包埋，切片法所不可能观察清楚的不足，因此是显微标本制备的中常用的手段。非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、离析法等1涂片法主要用于血液、尿液、微生物等不能切片成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层细胞，再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。2铺片法主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。如:洋葱表皮细胞的铺片制备。

3压片法一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖观察染色体，花粉粒观察发育阶段等。4离析法该方法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使细胞能分散成单个个体。经染色，脱水，透明即可观察其个体形态，适用于肌肉，叶片，茎等部位。5磨片用于很坚硬的组织，如骨和牙。2切片法

切片法是必须依靠手或切片机将组织切成薄片来进行观察的方法，根据所用支持剂的种类不同，可分为徒手切片法，石蜡切片法，火棉胶切法，冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要去蜡，染色，脱水，透明等步骤，将其制成永久标本。

2.1取材根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。

2.1.1动物的麻醉和杀死

从活的动物体上采取材料不象采集植物材料那么容易，因为在不施加麻醉的情况下，有的动物会收缩(如蚯蚓、水蛭)，有的会骚动(如蛙、鼠)，使我们无法下手。但制片所需的材料又要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要割取生活着的动物组织，在一般情况下，就要对动物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。

若是一般的组织学制片，要求不太严格的话则可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死，即用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如大竺鼠、免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒，或用50m1的注射器从耳静脉向心脏注入空气，使动物发生急性空气栓塞痉挛而死。取材注意事项1材料保持新鲜2组织块免受挤压3组织块力求小而薄4尽量保持组织原有形态5选取好组织块切面6选择动物品种和熟悉取材的解剖部位7切除不需要的部分8保持材料的清洁

2.2固定割取组织块后，应立即进行固定。固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣。除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。

2.2.1固定的意义

新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组织块后，应立即采用一种方法．将组织尽可能保持原有的形态结构，且有利于保存和适于制片的操作，这一步骤称为固定。固定的目的和作用在于：①使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来,防止组织自溶和腐败,从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构；②因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色；③固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化不易变形，有利操作。

2.2.2固定的方法

固定有物理方法和化学方法两种。物理方法固定有干燥、高热和低温骤冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；细菌涂片可用加热法固定；许多组织化学反应的制片是以低温骤冷固定作冰冻切片的。化学方法固定就是用化学试剂配制成固定液使之固定。

固定注意事项及影响因素1固定组织块不宜过大,以便固定液迅速渗透2软组织或较大块的组织可先经2-3小时的固定,然后修整成小块再重新投入新配制的固定液中继续固定3固定液的量是组织块大小的5-20倍为宜4固定时间的长短视固定剂的种类,气温,组织块的大小而定

2.2.3固定液的选择固定液的种类很多。可分为两大类：简单固定液和混合固定液。简单固定液又称单纯固定液，就是用一种化学试剂作为固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它们只是对细胞的某种成分固定得较好；不能将细胞所有的成分都保存下来。混合固定液就是用几种化学药品，按一定的比例混合配制而成，由于各种药品的优缺点互相弥补，因此可产生较好的效果。（3）按固定的方式将固定液分为两类：凝结型固定液：使蛋白质凝固，形成悬浮颗粒网状混合液。非凝结型固定液：不使蛋白质凝固，形成透明的凝胶。Ⅰ凝结型固定液：a酒精(alcohol)：70%-75%酒精渗透力最强。特点：①穿透速度快。②可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前两者所生成的沉淀不溶于水，核蛋白所生成的沉淀溶于水；所以经乙醇固定的标本对核的染色不良，不适于对染色体的固定。③浓度50%以上的酒精可溶解脂肪和类脂体。不能用于膜结构的研究，溶解血色素，破坏其他多种色素。④使糖原沉淀，但能溶于水。⑤是还原剂，在混合固定液中，酒精不能与氧化固定液混用。如铬酸、锇酸、重铬酸钾等。⑥使材料硬化、组织收缩明显。固定材料适宜浓度为70%-100%。不需冲洗，70%的酒精可较长时间保存，若长期保存材料与甘油等量混合后使用。b醋酸（aceticacid）特点：①穿透力速度极快。②能固定核蛋白，对胞质也存在固定作用。对核蛋白是凝结型固定液，对胞质是非凝结型固定液。使染色质和染色体的固定和染色均很好，因此所有固定染色体的固定液中几乎都有醋酸。③对脂类和糖类无固定作用。④对材料不但不硬化还有软化作用。对细胞无收缩作用，稍有膨胀作用。⑤不需冲洗，可投入70%的酒精中保存。固定材料适宜浓度为0.3%-5%。C铬酸（chromicacid）特点：①穿透速度缓慢。②能沉淀所有蛋白质，凝固核酸，增强核的着色能力，能固定高尔基体及线粒体。常用于细胞学观察。③对脂类无影响；固定糖原，使之不溶于水。④氧化剂，不能与酒精混用。必须用流水冲洗，直至组织中不含铬酸为止，如冲洗不干净或直接投入酒精中，被还原成绿色的氧化铬并发生沉淀，使染色困难。⑤使组织硬化，细胞收缩。⑥铬酸常配成2%或10%的水溶液作为储备液，固定适宜浓度为0.5%-1%。d苦味酸三硝基苯酚，不能结晶保存，要以饱和溶液存放。干燥时易爆炸。特点：①穿透速度中等。②可沉淀一切蛋白质。对脂类无影响，对糖类无固定作用。③细胞收缩明显，材料硬化程度很小。④不需冲洗，可直接投入70%酒精中洗去黄色。⑤固定材料适宜浓度为饱和溶液，即0.9%-1.2%。Ⅱ非凝结型固定液：（质量较好）A锇酸（OsO4）特点：a穿透速度很慢。材料要切的小一些，约1mm3。b不沉淀蛋白质，能使蛋白质被均匀固定，所以用锇酸固定的蛋白质能保持生活时的均匀性。c是脂肪和类脂类的很好的固定剂

。d强氧化剂，易挥发，毒性大。e不使细胞收缩，对细胞质固定好。固定物组织柔软。f流水冲洗12～24小时。使其完全洗净，否则遇乙醇就发生沉淀。g固定材料适宜浓度为0.5-2%。B甲醛：（不用于电镜制片）特点：a穿透速度快。b可与蛋白质化合形成不溶性的化合物而固定，固定脂肪和类脂类化合物。c还原剂，不能与氧化剂混用。d组织硬化程度显著，收缩小，但经酒精脱水后，收缩显著。e不需水洗，可直接投入70%的酒精。但经长期固定的材料，需经流水冲洗1-2天，否则影响染色。f市售的为37-40%甲醛，称为福尔马林，固定和保存材料的适宜浓度是10%福尔马林。

Ⅲ混合固定液：A卡诺(Carnoy)氏固定液：配方：酒精：冰醋酸:氯仿=6:1:3此液适于固定一般动物组织和肝糖原以及植物组织。（多用于细胞学研究）穿透速度快，为防止组织硬化，固定时间不要超过24小时。时间以材料的不同而有所区别，根尖15min,花药1小时,糖原在3-5℃下固定,小白鼠睾丸30-50min。固定后可转入70%中保存，可直接经95%酒精，纯酒精脱水。Bouin液配方：饱和苦味酸水溶液:37％－40％甲醛液:冰醋酸＝15:5:1其中冰醋酸能固定染色质,苦味酸能使组织适当硬化,甲醛液可调节另两种试剂对组织的膨胀作用.因此,此混合液对组织收缩或膨胀的作用较小,并渗透力强,固定均匀,适合绝大多数器官及组织的固定,能显示出组织的细微结构,而且染色效果良好,尤其是细胞核的着色.

Zenker固定液：配方:升汞5.0g

重铬酸钾2.5g

蒸馏水(加至)100ml临用前加入冰醋酸.经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清晰，但成本较昂贵且需特殊处理汞。该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。

(4)固定时应注意的问题：①固定的材料越新鲜越好，立即固定。②材料与固定液比例一般为1：20。③根据材料的性质和制片的目的选择固定液。④有时要用蔗糖、氯化钠来调节渗透压。⑤材料外表有毛或其他不易穿透的物质存在，可先在含酒精的固定液中固定几分钟，再换用含水的固定液。⑥含有气体的材料投入固定液后，不下沉，须将气体抽出。方法可采用真空泵，或用注射器的简易方法。⑦材料固定后一定要做标记。3.冲洗：(1)目的：所谓洗涤，即用洗涤剂渗透到材料中，把固定剂洗掉，洗涤必须彻底，才能进行下一步操作。否则留在组织中的固定液有的防碍染色，有的会发生沉淀物或结晶而影响观察，有的可以继续发生作用，破坏材料或影响以后的处理。(2)洗涤的原则与方法：常用的洗涤剂是水和低浓度的乙醇。①固定液用水配的，就用水或流水来冲洗；不需流水冲洗的材料，放在小瓶内，换数次水，每次1-2小时。②用各种浓度的酒精配的，就要用与固定液相近浓度的酒精冲洗；材料：酒精=1：10。③用福尔马林固定的不用水洗，但长期固定的，应充分水洗，否则影响染色。④用铬酸、重铬酸钾等固定的材料就用流水冲洗。冲洗时间应和固定时间相同或再长。

4.脱水：

就是用一种溶剂把材料中的水份全部代替干净。(1)脱水原因：在制作永久制片时，组织冲洗完毕后必须进行脱水，因组织固定和水洗后含大量水分，而水不能和石蜡包埋剂混合，组织内只要有极少量水份，就会防碍包埋剂的渗入。(2)脱水的结果：使材料变硬，形状更加稳定，利于组织永久保存。除尽材料的水份，才能使透明剂、包埋剂、封藏剂渗透到组织中，有利于组织的透明和浸蜡。(3)脱水剂应具备的两个特性：①必须是亲水性，能与水以任何比例混合，代替细胞中的水份。②必须能和其他有机溶剂混溶取代。

(4)脱水的方法：脱水应逐步进行，而不能骤然进行，否则会引起组织的强烈收缩，或使材料变形。一般把脱水剂配成各种浓度，材料自低浓度到高浓度依次经各级脱水剂，其中所含水份逐渐被脱水剂取代。(5)脱水剂分为两类：

①非石蜡溶剂的脱水剂：如乙醇、丙酮等，组织脱水后必须经二甲苯透明才可浸蜡。②石蜡溶剂的脱水剂：如正丁醇等，组织脱水后即可直接浸蜡，不需经过中间溶剂二甲苯之类的药品。(6)常用的脱水剂：乙醇：按浓度梯度依次进行35%→50%→70%→83%→95%→100%→100%；在各级停留的时间根据材料而定，体积为2mm3的一般每级为1-4小时；在低浓度酒精中，每级停留的时间不易过长，否则易使组织变软，助长材料解体。从95%到100%乙醇后，时间不能太长，否则材料变硬变脆，影响切片。为使乙醇脱水彻底，应更换两次100%乙醇。如需过夜应停留在70%酒精中。脱水时的注意事项：a脱水必须要在有瓶盖内进行，尤其是高浓度乙醇很容易吸收空气中的水份。b组织由低浓度向高浓度的乙醇转移时，要用吸水纸吸干余液，以免将水份带入。C组织脱水要彻底.纯乙醇中如有水，可加无水硫酸铜以吸去水份。注：在每级中停留的时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。5.透明：材料经脱水剂去水分后，还要经过一种既能与脱水剂，又能与包埋剂相混合的溶剂—透明剂来处理，以便于包埋剂的渗入或封藏。在制片过程中有两次透明：第一次是组织块的透明，为了引入包埋剂；第二次是染色以后切片的透明，为了引入封藏剂。常用透明剂：透明剂都是石蜡的溶剂，绝大多数不能与水混合，最常用的透明剂有二甲苯,苯a二甲苯：目前应用最广。易溶于乙醇，又能够溶解石蜡，加拿大树胶，透明力强，作用较快。其最大缺点是容易变硬变脆，材料必须脱尽水分再透明，否则发生乳状浑浊。在材料进入二甲苯前，为了减少材料收缩，材料须经过1/2二甲苯+1/2无水乙醇→二甲苯（I）→二甲苯（II）→1/2二甲苯+1/2石蜡→纯石蜡材料在二甲苯中时间不宜过长，否则材料收缩变硬、变脆。一般组织块透明总时间3-4小时（每级60-120分钟），染色后的切片透明每级5-10分钟。

6.浸蜡与包埋：

组织经过透明后要让石蜡支持剂透入细胞内部使它变硬，并将组织包埋进去，把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成薄片。以利于切片和观察，这个过程称为“浸蜡”和“包埋”。

(1)石蜡的熔点多为50-60℃。选用不同熔点的石蜡的原则：①石蜡硬度与组织硬度相近似，组织较硬时，用硬的石蜡，反之用软的石蜡。一般动物材料石蜡的熔点为52-56℃，植物材料石蜡的熔点为54-58℃。②切片较薄时（4um以下），石蜡的熔点为58-60℃。③最重要的要看室内温度，通常在夏天用熔点高的石蜡（硬蜡），冬天用熔点低的石蜡（软蜡）。石蜡太硬，切片时容易破碎，不易切成蜡带，太软时，蜡带容易皱缩。

(2)浸蜡：

材料经透明后，倒入二甲苯，再在上面倒入60℃的石蜡，使石蜡：二甲苯=3：2；放在35-37℃的恒温箱中浸蜡1-2天。后将温箱升至60℃，将石蜡和二甲苯倒出，换纯石蜡两次，每次40分钟至1小时。在

60℃温箱中最多放5-6小时。动物材料在透明剂与石蜡等量混合液中15-30分钟，再换纯石蜡两次，每次1-1.5小时。浸蜡注意事项

1尽量保持在较低的温度中,以石蜡不凝固为度2力求在最短限度时间内完成石蜡透入的过程.温度过高,或时间过长都会引起组织变硬,变脆,收缩等,影响结果3浸蜡用的石蜡要定期更换,以保持纯度（3）包埋：

组织被石蜡透入达到饱和的程度后,就需要进行包埋.所谓包埋就是被石蜡浸透的组织连同熔化的石蜡,一起倒入一定形的容器内(如纸盒)内,并立即投入冷水中,使它立即凝固成蜡块的过程.

步骤：纸盒放于烫板上，将石蜡和材料一起倒出，用加温后的解剖针将材料调到合适的位置，标签有文字的一面向下。再补足石蜡。轻轻提起纸盒的两侧的把手，慢慢平放于盆的水面上，待纸盒内石蜡表面已凝固，即可将纸盒向一侧倾斜，使其立即进入冷水中，迅速凝固，经30min-1h后，取出晾干。包埋中出现的问题及解决办法问题:包埋后的石蜡块应为均匀的半透明状态,但是有时候出现白色浑浊的结晶部分,这样在切片时就有妨碍原因:1脱水不干净2组织内部或石蜡中混有透明剂3石蜡本身品质不良4组织块倒如纸盒时,周围的石蜡已成凝固状态5石蜡冷凝得太慢7.切片：

石蜡切片，用旋转切片机。一个旋转切片机，可分三个部分，一个是安装切片刀的部分，有调节刀片斜度和固着刀片的螺旋。一个是安装材料的部分，也有螺旋可以调节材料的位置。另一个是操纵在旋转中向前推进的部分，控制着切片的厚薄，是比较重要而复杂的部分。8.贴片：贴附牢固，在染色时不易脱落；使皱褶的蜡片伸展平整。用具：载玻片、粘片剂、解剖刀、蒸馏水、展片机及铐片机。A将展片机温度调整到42℃，保持恒定。B在载玻片上涂蛋白甘油等粘片剂。C将涂粘片剂的载玻片放在展片机上，滴加蒸馏水数滴，此时若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示玻片不清洁，有残留油脂等物在上面。D用解剖刀将蜡带切成小段，每段的长度应以盖玻片的长度为准，一般应比盖玻片短约1/5-2/5。分片应从蜡带交界处分。F将蜡带轻轻移到涂有水的载玻片上，蜡片光面应向下贴在载玻片上，依次排列整齐。留出右端贴标签处。G材料展平后，从展片机上取下，稍稍倾斜留出多余的水分，用吸水纸吸干背面及周围多余水分，放于烤片机（42℃）上烤干水分。切片的方法主要有（ABCD）A石蜡切片法B冰冻切片法C塑料包埋切片法D半超薄切片法E整体封藏法F分离法

石蜡切片术中用于固定的组织块大小一般为(

C

)

A.1.0mm左右

B.1.0cm左右

C.5.0mm左右

D.5.0cm左右在病理组织制片过程中,取材的要求一般为：(ABCE)A.一般厚度0.2-0.3cm

B.大小0.2~0.3×1.5×1.5cmC.免疫组化染色用组织以1×1×0.2cm为好D.冰冻切片组织块可厚至0.3-0.4cmE.特殊需要也可大于以上大小组织固定的意义是（）A.使蛋白质迅速溶解B.防止细胞自溶C.使组织膨胀D.使组织坚硬E.防止组织腐组织固定时所使用的固定液的量一般为()A2倍B4倍C8倍D10-15倍下列物质那些能固定蛋白质（）A乙醇B苦味酸C醋酸D铬酸E重铬酸钾F福尔马林即能固定白蛋白又能固定核蛋白的物质是（）A乙醇B醋酸C福尔马林D铬酸E苦味酸 F重铬酸钾固定高尔基体和线粒体的固定剂可选（）A乙醇B福尔马林C醋酸D苦味酸E重铬酸钾固定剂乙醇可以与那些物质混合使用（）A福尔马林B醋酸C铬酸D锇酸E升汞固定速度最慢的物质是（）A乙醇B福尔马林C醋酸D苦味酸固定后不会发生组织收缩的物质有（）A乙醇B福尔马林C醋酸D苦味酸E重铬酸钾F铬酸甲醛属于常用的单纯组织固定液，对其描述下面错误的是()A．相对而言，甲醛水溶液渗透能力强组织固定均匀B．甲醛价格较低，可用于固定和保存大体标本C．长时间固定的标本，形成的甲醛色素沉积无法去除，故而组织固定不能时间过长D．长时间固定的标本，形成甲醛色素沉积可用乙醇配氨水去除E．甲醛固定能保持脂类和类脂类对于重铬酸钾固定剂，对其描述下面错误的是A．重铬酸钾为橙红色晶体，有毒B．用于固定高尔基体和线粒体效果较好C．组织穿透速度快D．重铬酸钾固定的组织明显收缩E．重铬酸钾固定的组织，酸性染料着色良好那些固定剂固定后需要用水清洗（）A福尔马林B醋酸C苦味酸D重铬酸钾Ecarnoy液F铬酸G升汞对于组织固定后的脱水，下面的描述不正确的是()A．脱水是借某些溶媒置换组织内水分的过程B．脱水剂必须能与水以任意比例混合C．根据固定剂的要求选择脱水剂D．根据被固定组织的要求选择脱水剂E．乙醇是最常用的脱水剂属于非石蜡溶剂的脱水剂（）属于石蜡溶剂的脱水剂（）A乙醇B丙酮C叔丁醇D正丁醇F环己酮组织脱水后不需要透明直接浸蜡的脱水剂有（）A乙醇B丙酮C正丁醇D叔丁醇关于透明剂二甲苯的叙述正确的是（）A材料在二甲苯中停留过久，容易使材料收缩而变硬变脆B在封片前使用，不易使已染色的切片褪色C通常不直接移入二甲苯中，而是其间经过几个级度D对脱水不净的切片，二甲苯不易进入材料，故石蜡也不能透入，切片后将在蜡片上出现空洞不能用于已染色后的切片的透明的是（）A甲苯B二甲苯C苯D氯仿选用不同熔点的石蜡的原则：A石蜡硬度与组织硬度相近似，组织较硬时，用硬的石蜡，反之用软的石蜡。。B切片较薄时（4um以下），石蜡的熔点为58-60℃.C通常在夏天用熔点高的石蜡-硬蜡，冬天用熔点低的石蜡-软蜡。D浸蜡用石蜡的熔点应该低于包埋用石蜡的熔点，这样石蜡才容易透入。E石蜡浸蜡和包埋切极薄的片子时,将2-3种不同熔点的石蜡混合使用，可得到较好的效果。包埋后的石蜡块出现白色浑浊的石蜡结晶，原因是（）A材料脱水不充分B材料或石蜡中混有透明剂C包埋时动作太慢，组织块进入包埋框时框内四周的石蜡已成凝固状态D石蜡凝固太慢也会产生结晶。E石蜡本身品质不良关于石蜡包埋叙述正确的是（）A注意温度的控制，包埋时温度太高，石蜡凝固太慢，会在蜡块中出现气泡B如果将蜡块突然放入水中，蜡块会产生破裂；C温度过低时材料与其周围的石蜡不能凝固得紧密，也不易赶走气泡，而不能切片。D夏季采用熔点较高的石蜡,冬季宜选用熔点较低的石蜡

切片染色后封片常用中性树胶（加拿大树胶）主要是因为：()A.树胶与玻璃的折射率不相等B.树胶与玻璃的折射率几乎相等C.树胶的折射率比玻璃大D.树胶的折射率比玻璃小E.树胶的折射率为1组织切片常见问题与对策图1、2蜡块的上下两边与刀片的水平线不平行图4蜡块粗修时没有完全修全,组织没有充分暴露最大面就急于裱片,切片上形成许多不规则的空洞图6当切蜡块用的力太猛太重时,组织中的小斑点、小斑块从蜡块中脱落,在切片上留下一个个小空洞图单张切片,用镊子沿蜡块的底端平行牵拉,可形成蜡带图12、13切片跳片或厚薄不均图15刀刃有缺口,造成切片有裂隙图16、17组织内有异物,造成切片有粗细不等的划痕图18切片刀上有碎组织废屑或碎蜡屑等异物,造成切片上有轻微的划痕图26皮肤切片边缘折叠图27子宫肌瘤组织切片在漂烘仪水面没有完全展开形成皱折图28切片在漂烘仪水面没有完全展平,与载玻片帖附不牢固,形成波浪状起伏,显微镜下难以聚图22组织切片在漂烘仪展片时形成的气泡,经烘/烤片后染色时气泡破裂,造成破裂区域染色深染9.染料与染色：[1]染色剂的性质：具备两个性质，一要具有颜色，二要与被染组织间有亲和力。

如果只有颜色而与被染物体之间无亲和力，那只能是颜料或合色