月季花药培养(公开课)

花中皇后月季又称“月月红”，自然花期5至11月，开花连续不断，通常扦插就可以成活。

课题2月季的花药培养知识回顾花药培养的原理（单倍体育种的过程？）花药离体培养（N）单倍体植株（N）秋水仙素处理，使染色体加倍植株（2N）优点：1明显缩短育种年限2后代植株都为纯合子。正常植株（2N）（一）被子植物的花粉发育（1）被子植物定义：凡是种子有果皮包被着，胚珠有子房壁包被着的植物，就叫做被子植物（绿色开花植物）1、被子植物和裸子植物（2）裸子植物定义：凡是胚珠裸露，外面没有子房壁包被，种子外面没有果皮包被的植物称为裸子植物（无真正意义上的花）实例：玉米、大豆、梨、杏实例：松、杉、柏一、基础知识花药花丝（一）被子植物的花粉发育花丝花药：囊状结构，内有很多花粉（一）被子植物的花粉发育雄蕊花药药隔：花药中部，由薄壁细胞构成，内有维管束（疏导组织）花粉囊（4或2个）表皮纤维层（3）花药的结构：（4）被子植物的花粉发育①经历时期：四分体时期、单核期、双核期等阶段②花粉发育过程：花粉的概念:由花粉母细胞经过减数分裂形成的单倍体的生殖细胞.小孢子母细胞（花粉母细胞）减数分裂4个小孢子（小孢子四分体时期）

1个小孢子（单核居中期）：这时的细胞含有浓厚的原生质，核位于细胞中央称为单核居中期②花粉发育过程：4个单倍体细胞连在一起，进入单核期时（四分体的4个单倍体细胞彼此分离，各自形成具有4个单细胞核的花粉粒）有丝分裂1个小孢子（单核靠边期）：随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧称为单核靠边期花粉管细胞核生殖细胞核营养细胞生殖细胞有丝分裂2个精子（基因型相同）双核期两个精子和一个营养核的基因型相同生殖细胞核与花粉管细胞核基因型相同；（一）被子植物的花粉发育减数分裂细胞生长小孢子母细胞或花粉母细胞2N4个小孢子N四分体时期1个小孢子N单核居中期单核靠边期N单核花粉粒有丝分裂有丝分裂精子（花粉或花粉细胞）营养细胞核双核花粉粒N×2三核花粉粒N×3（二）产生花粉植株的两种途径1、体细胞胚（胚状体）：在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，其发育过程亦与合子胚类似。（二）产生花粉植株的两种途径2、产生花粉植株的两种途径：通过花药培养产生的花粉植株（单倍体植株）一般有两种途径：一种是花粉通过胚状体阶段发育为植株；另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将愈伤组织诱导分化成植株。①花药中的花粉②花药中的花粉脱分化胚状体（花粉胚）分化丛芽脱分化愈伤组织再分化丛芽诱导生根移栽两种途径之间无绝对界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。诱导花粉植株能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要影响因素。（三）影响花药培养的因素①不同植物的诱导成功率很不相同；②同一种植物的生理状况对诱导成功率也有直接影响：花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。一般月季的花药培养时间选在5月初到5月中旬，即月季的初花期。选材是否成功是花药培养成功的关键（1）选材1、材料的选择：花期：花期一般指在一个生长季内植株开花的时间段。比如某些种类的月季，从5月初一直到11月都连续开花。那么5月初就叫做该种月季的初花期或花期早期。花期早期的花蕾营养状态及生理状态都比较好，能提高花粉诱导成功率。选材是否成功是花药培养成功的关键（2）花药培养时期的选择：合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素①原因：因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。（三）影响花药培养的因素一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最适合花药培养的小孢子发育时期为单核靠边期。②花药时期选择：单核靠边期。选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎；选择单核期之后的花药接种，花瓣松动，又给材料的

消毒困难，且难以挑选到单核期的花药。③其它时期选择的缺点④单核期花药的挑选：通常选择完全未开放的花蕾。盛开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。⑤选择完全未开放花蕾的原因：花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药给材料的消毒带来困难。旁栏思考：为什么花瓣松动会给消毒带来困难？

可挑选到单核期的花,菌少、易消毒2、培养基的组成：培养基的组成会影响脱分化与再分化花药培养基可能因植物的不同而有所变化如小麦中为N6马铃薯、月季中为MS油菜中为B5培养基月季花药培养基配方：在1000mlMS培养基配方中添加2,4—D(0.4mg)、KT(0.2mg)、IAA(4mg)；调节PH至5.83、其他影响因素：如亲本的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度对诱导成功率都有影响。月季花药培养时的花粉粒最好是（）A、四分体时期B、二核或三核花粉粒C、单核期C实验操作一、材料的选取二、材料的消毒三、接种和培养（一）材料选取

2、通过镜检来确定是否处于适宜的发育期。方法：醋酸洋红法(将染色体染成红色)

焙花青-铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色)。1、从花药看：从花粉看：

从花蕾看：花药（载玻片上）→1%的醋酸洋红1滴→用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）花药（在卡诺氏固定液中处理20min）→取出，置于载玻片上→焙花青－铬矾溶液染色→盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）月季的初花期单核期完全未开放的（二）材料的消毒5、无菌水冲洗3～5次

花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态1、花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒2、无菌水清洗3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2～4分钟（质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）（三）接种和培养

1灭菌后花蕾，要在

下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。

3通常每瓶接种花药

，温度控制在

左右，

。幼小植株形成后才

。

2在剥离花药时，要尽量

（否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体愈伤组织），同时还要彻底

，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小的植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。无菌条件不损伤花药去除花丝7-10个25℃不需要光照需要光照部分花药通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养胚状体发育途径愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养愈伤组织发育途径部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药

鉴定和筛选：常常会出现染色体倍性的变化主要原因是花粉管核和生殖核融合造成的植物组织培养技术与花药培养技术的比较项目植物组织培养花药培养技术相同点1培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。2都经过了脱分化不同点1离体培养的外植体为体细胞。2有丝分裂的过程，染色体数量不变。1花粉是生殖细胞，得到的单倍体植株，弱小且高度不育。2秋水仙素处理，染色体加倍，恢复正常的染色体数，为纯种。谢谢练习：小麦高杆（D）对矮杆（d）为显性，抗锈病（T）对不抗锈病（t）为显性，现有高杆抗锈病和矮杆不抗病的两种纯合体，要获得矮杆抗锈病的良种，可用杂交育种和单倍体育种法，步骤如下：

高杆抗锈病（DDTT）×矮秆不抗锈病（ddtt）

F1：的基因型和表现型

a各种配子的种类

a

↓符合要求的单倍体的基因型