分子生物学第五、六章 DNA的损伤、修复、基因突变、重组与转座

第5章

DNA损伤、修复、基因突变

5.1DNA的损伤由于染色体DNA在生命过程中占有至高无上的地位，DNA复制的准确性以及DNA日常保养中的损伤修复有着特别重要的意义。DNA损伤是指在生物体生命过程中DNA双螺旋结构发生的任何改变。主要分为两种：单个碱基改变双螺旋结构的异常扭曲（链内T二聚体、单链缺口、凸起等）引起DNA损伤的因素很多，包括：DNA分子自发性损伤物理因素损伤化学因素损伤

DNA复制过程中的损伤指碱基配对时产生的误差经过DNA聚合酶等综合校对因素作用后仍未被校正的DNA的损伤。如：大肠杆菌DNA复制无DNA聚合酶校正时错配率为10-1~10-2，识别校正后为10-5~10-6，再经过其他因素，错配率达到10-10这类损伤主要包括5种因素5.1.1DNA分子自发性损伤指碱基发生烯醇式-酮式结构互变时，氢原子位置的可逆变化，使碱基配对发生改变，这样在复制后的子链上就可能出现错误。

如：A、C或G、T错配

互变异构移位

主要指胞嘧啶C、A和G分子结构中都含有环外氨基，氨基有时会自动脱落，使得C变为U，A变为I，G变为X，当DNA复制时，会在链中产生错误导致损伤。A—I—C(非T)下一轮C—G导致AT—GC引起突变C—U–A(非G)下一轮A—T导致GC—AT引起突变

亚硝酸盐、羟胺诱变剂脱氨试剂

DNA复制时，无论模板还是新生链都会发生碱基的环出现象，即DNA聚合酶发生“打滑”，引起一个或数个碱基的插入或缺失。尤其是模板上有几个相同的碱基情况。DNA聚合酶的“打滑”细胞的氧化代谢产生的氧自由基活性很高，DNA碱基至少会遭受到20种氧化损伤。活性氧为氧分子电子数大于O2的O2-

可与

C、A配对，DNA聚合酶不能矫正其错误，造成GC—TA颠换，这种损伤可以积累。活性氧引起的诱变DNA分子在生理条件下可通过自发性水解，使嘌呤碱和嘧啶碱从磷酸脱氧核糖骨架上脱落下来。哺乳动物每个细胞每20h脱去的嘌呤碱和嘧啶碱数分别平均为1000个和500个。碱基丢失

紫外线(UV)照射引起的DNA损伤主要是同一条链内相邻2个嘧啶形成嘧啶二聚体，阻碍DNA的复制和转录。

ATTCGAGTTAGCTAAGCTCAATCG

因此人皮肤照射紫外线，伤害很大，致癌5.1.2物理因素引起的损伤电离辐射引起DNA损伤直接引起DNA理化性质改变细胞水分解离，产生氧自由基诱变碱基改变最终能引起DNA链断裂及DNA链间交联，DNA-蛋白交联等。烷化剂对DNA的损伤烷化剂是一类亲电子化合物，很容易与体内大分子负电中心作用。当烷化剂和DNA作用时，可以将烷基加到核酸的碱基上去。结果是形成链内或链间交联。

6.1.3化学因素引起的损伤碱基类似物对DNA的损伤是一类结构与碱基相似的人工化合物，5-溴尿嘧啶（5-BU）与U结构类似，酮式能与A配对，烯醇式能与G配对。结果引起A-T----G-C转变。

DNA修复是生物体细胞在长期进化中形成的一种保护功能，在遗传信息传递的稳定性方面具有重要作用。5.2DNA的修复直接修复切除修复错配修复重组修复易错修复和SOS应急反应细胞DNA损伤的修复系统主要有：直接修复包括光复活修复、06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶修复、单链断裂修复在DNA光解酶(Photolyase)的作用下把在光下或经紫外光照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二体及6-4光化物(6-4photoproduct)还原成为单体的过程。生物体内还广泛存在着使06-甲基鸟嘌呤脱甲基化的甲基转移酶，以防止形成G-T配对。DNA单链断裂可以通过重接（DNA连接酶），直接修复。切除修复

包括碱基切除修复和核苷酸片段切除修复碱基切除修复：所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能特异性切除受损核苷酸上的N-β－糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点（AP位点）。DNA分子中一旦产生了AP位点，AP核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链。

核苷酸片段切除修复

当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，则由核苷酸切除修复(nucleotide-excisionrepair)系统负责修复。损伤发生后，首先由DNA切割酶(exci-nuclease)在已损伤的核苷酸5’和3’位分别切开磷酸糖苷键，产生一个由12～13个核苷酸(原核生物)或27～29个核苷酸(人类或其他高等真核生物)的小片段，移去小片段后由DNA聚合酶Ⅰ(原核)或ε(真核)合成新的片段，并由DNA连接酶完成修复中的最后一道工序。错配修复错配修复可以将DNA子链中的错配几乎完全能被修复。该系统识别母链靠Dam甲基化酶，它能使位于5’GATC序列中A的N6位甲基化。一旦复制叉通过复制起始位点，母链就会在开始DNA合成前的一小点时间（几秒钟至几分钟）内被甲基化。此后，只要两条DNA链上碱基配对出现错误，错配修复系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游G的5'位置切开子链。切除修复发生在下一轮DNA修复前，又称复制前修复。机体细胞对在复制起始时尚未修复的DNA损伤部位可以先复制再修复，这种方式称为重组修复。这个过程发生在复制后，又称复制后修复。重组修复复制重组再合成重组修复机制的缺陷，有可能导致肿瘤发生。已经发现，妇女Brca1和Brca2两个基因如果有缺陷，发生乳腺癌的概率为80%。这两个蛋白质参与重组修复。

错配修复、直接修复、切除修复和重组修复都能够识别DNA的损伤部位或错配碱基而加以消除，在这些修复过程中不引入错误碱基，属于避免差错的修复。易错修复和SOS应急反应当无法为修复提供正确模板时，如模板链损伤、双链断裂、双链交联等，正常复制受阻，导致易错修复。许多能造成DNA损伤或抑制DNA复制的过程能引起一系列复杂的诱导效应，这种效应称为应急反应(SOSresponse)。SOS包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶源性细菌释放噬菌体等，细胞癌变也与SOS反应有关。SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施。SOS反应诱导的修复系统包括：避免差错的修复（errorfreerepair）和易产生差错的修复（errorpronerepair）两类。由于SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，所以在DNA链的损伤部位即使出现不配对碱基，复制也能继续进行，以保证细胞的存活，叫易产差错的修复。SOS反应广泛存在于原核和真核生物，它是生物体在不利环境中求得生存的一种基本功能。SOS反应意义：①DNA的修复；②导致变异。作为遗传物质的DNA有三个主要功能：①通过复制将遗传物质由亲代传给子代；②通过转录使遗传信息在子代得以表达；③通过变异在自然过程中获得新的遗传信息。5.3基因突变基因突变(mutation)：是在基因发生可遗传的结构和数量的变化，通常产生一定的表型。广义的突变包括染色体畸变和基因突变。遗传重组也导致可遗传的变异，因此，染色体畸变、基因突变、遗传重组是可遗传变异的基础。1、碱基对置换：指DNA错配对碱基在复制后被固定下来，由原来的一个碱基对被另一个碱基对所取代，又称为点突变。碱基对置换有转换和颠换两种。2、插入突变：指在基因的序列中插入了一个碱基或一段外来DNA导致的突变。包括同义突变、错义突变和无义突变。基因突变的类型3.移码突变：一个或多个非三整倍数的核苷酸对插入或缺失，导致编码区位点后的三联体密码子可读框改变，从而使后面的氨基酸都发生错误，是基因产物失活。4.渗漏突变：突变基因的产物尚有部分活性的错义突变。5.回复突变：从突变体回复原先野生型表型的突变过程。在自然条件下发生的突变称为自发突变。自发突变的频率很低，大肠杆菌及果蝇突变率10-10左右。能够提高突变率的物理或化学因子称为诱变剂(mutagen)。碱基类似物：5-BU与T结构相似；碱基修饰剂：亚硝酸；烷化剂；嵌合染料(EB)；紫外线和电离辐射诱变剂种类及机制4.4.3基因突变的主要后果生物功能丧失获得新功能癌症发生作业名词解释：基因突变无义突变移码突变回复突变简答题：课后思考题1和4

4.5DNA的重组DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组或基因重组。重组产物称为重组体DNA(recombinantDNA)。真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。细菌及噬菌体的基因组为单倍体，来自不同亲代两组DNA之间可通过多种形式进行遗传重组。遗传变异的根本原因是突变。然而突变的机率很低，且多数是有害的。如果生物只有突变没有重组，在积累具有选择优势突变的同时不可避免地积累许多难以摆脱的不利突变。有利突变随不利突变一起被淘汰，新的优良基因就不可能出现。DNA重组对生物进化起着关键性的作用。4.5.1同源重组同源重组(homologousrecombination)：由两条同源区的DNA分子，通过配对、链断裂和再连接，而产生的片段间交换的过程。Holliday模型详见书本图和遗传学教材4.5.2细菌的基因转移与重组细菌的基因转移主要有四种机制：接合(conjugation)、转化(transformation)、转导(transduction)和细胞融合（cellfusion）。①细菌的接合细菌的细胞相互接触时遗传信息可由一个细胞转移到另一细胞，称为接合作用。供体细胞为雄性，受体为雌性。通过接合而转移DNA的能力由接合质粒提供，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子(fertilityfactor，F因子)。大肠杆菌F因子是双链闭环的大质粒，总长约100kb，复制起点为ori

V。F因子可以在细胞内游离存在(F+)，也可以整合到宿主染色体内(Hfr)。整合F因子的大肠杆菌菌株具有较高频率的重组(high-frequencyrecombination)，称为Hfr菌株。F因子可以整合在染色体不同位置，由此而得到不同的Hfr菌株。②细菌的遗传转化遗传转化(genetictransformation)是指细菌品系由于吸收了外源DNA而发生遗传性状的改变现象。感受态细胞（competentcell）：受体细胞经过一些特殊方法（如电击、CaCl2）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态。③细菌的转导转导(transduction)：是通过噬菌体将基因从供体转移到受体细胞的过程。④细菌的细胞融合由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。在实验室中用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使其成为原生质体，可人工促进原生质体融合，由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。第七章DNA重组与转座4.6DNA的转座转座子（transposon）：是在基因组中可以移动的一段DNA序列。一个转座子由基因组的一个位置转移到另一个位置的过程称为转座或移位(transposition)。本质是由转座子（可移位因子）介导的遗传物质重排现象。转座子是一些较短的DNA序列，可以转移到细胞基因组的任何位置。由于它不需要序列间具有同源性，也不是位点特异性的，所以转座作用又被称为异常重组。与DNA的同源重组相比，转座作用发生的频率要低得多。转座作用能说明在细菌中发现的许多基因缺失或倒位现象，而且它常被用于构建新的突变体。T-DNA标签技术。转座作用的特点①能从基因组的一个位点转移到另一个位点（又称跳跃基因）；②不以独立形式存在；③转座子编码自身的转座酶；④转座的频率很低；⑤转座作用可引起基因表达内容的改变甚至失活。转座可分为复制性和非复制性两大类。在复制性转座中，整个转座子被复制，所移动和转位的是原转座子的拷贝。转座酶和解离酶分别作用于原始转座子和复制转座子。在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位。4.6.1转座子的分类和结构特征转座子(transposon，Tn)：是存在于染色体DNA上可自主位移（非复制性）和复制（复制性）的基本单位。1、IS序列最简单的转座子只含有与转座有关的酶基因，不含有任何宿主基因（包括抗药性基因），常被称为插入序列(insertional

equence，IS)。

IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。科学上用标准命名法对这些突变进行编号，如λ::IS1表示有一个IS1的序列插入到噬菌体λ基因组内。表2-13IS序列的结构特征比较长度/bp两端倒置重复区/bp靶位点正向重复区/bp靶位点IS1IS2IS4IS5IS10RIS50RIS90376813271428119513291531105723411816229189511或124999随机有热点AAAN20TTT有热点NGCTNAGCN有热点未知它们都是很小的DNA片段(约lkb)，末端具有倒置重复序列，转座时往往复制宿主靶位点一小段(4～15bp)DNA，形成位于IS序列两端的正向重复区。2、复合型转座子复合型转座子(compositetransposon)：是一类除了转座酶基因之外，还带有抗药性基因(或其他宿主基因)的转座子。因结构大而复杂，故称为复合转座子。其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子(图2-32)。Ⅰ型：图2-32一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只有作为复合体移动。

Ⅱ型主要指TnA家族:没有IS序列、体积庞大(5000bp以上)、带有3个基因，其中一个编码β-内酰胺酶(AmpR)，另两个则是转座作用所必须的。这类转座子两翼带有38bp的倒置重复序列。

复合型转座子的特点①末端反向重复序列，为转座酶所必须；②中间的开放阅读框架（ORF）作为标记基因；③转位后靶位点成为正向重复序列。4.6.2转座作用的机制转座时发生的插入作用的普遍特征是受体分子中有一段很短的(3～l2bp)、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度是一样的，如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。靶序列的复制起源于特定内切酶所造成的粘性DNA末端。4.6.3转座作用的遗传学效应(1)转座引起插入突变各种IS、Tn都可以引起插入突变。如果插入位于某操纵子的前半部分，就可能造成极性突变，导致该操纵子后半部分结构基因表达失活；(2)转座产生新的基因如果转座子上带有抗药性基因，它一方面造成靶DNA序列上的插入突变，同时也使这个位点产生抗药性；(3)影响插入位置邻近基因的表达，使宿主表型改变;(4)转座产生的染色体畸变;若同源重组发生在两个正向重复转座区之间，就导致宿主染色体DNA缺失；若重组发生在两个反向重复转座区之间，则引起染色体DNA倒位。（5）转座引起的生物进化由于转座作用，使一些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，可能产生一些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子。4.7真核生物中的转座子早在20世纪初，遗传学家就已发现玉米中存在决定体细胞变异的控制因子（controllingelement），事实上就是转座子。20世纪40年代，BarbaraMcClintock在美国康奈尔大学和冷泉港实验室所进行的开创性工作，打破了孟德尔关于基因固定排列于染色体上的概念，在当时几乎不能被科学界所接受，直到1983年终于在分子水平上得到证实，并使她获得了诺贝尔生理医学奖。玉米细胞内的控制因子可归纳为两大类：一类是自主性因子，具有自主剪接和转座的功能；另一类是非自主性因子，单独存在时是稳定的，但不能转座。当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时，它才具备转座功能，成为与自主性因子相同的转座子。同一家族的自主性因子能为非自主性因子的转座提供反式作用蛋白（转座酶），而不同家族间无此反应。研究发现，玉米转座子同样具有典型的IS特征——在转座子的两翼有两个倒转重复序列，在靶DNA插入位点有两个短的正向重复序列。在著名的Ac-Ds体系中，自主转座子Ac长4563bp，转录生成单一RNA。成熟mRNA长3500bp，并含有一个长807个密码子的开放读码框，被4个内含子分隔成5个外显子。Ac转座子的两翼有11bp的倒转重复序列，在其靶DNA位点复制形成8bp正向重复。已知所有Ds都是Ac转座子的缺失突变体，如Ds9只缺失了194bp，而Ds6缺了约2.5kb。非自主性转座子虽然缺失内源序列，但