微生物的生长

第六章微生物的生长与环境条件第一节微生物的生长

微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自己的代谢方式进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。各种细胞组分按恰当比例增长到一定程度后就会引起个体数目的增加，这就是繁殖。一、微生物的生长微生物在自然界中不仅分布很广，而且都是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必须把混杂的微生物类群分离开来，以得到只含一种微生物的培养。微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。最常用的方法有稀释平板法、划线法、单细胞挑取法及利用选择培养基分离法等。二、微生物的纯培养

这是最常用的纯种分离法，先将待分离的材料作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1000……)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，平皿上就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。稀释平板法

将已熔化的培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，用接种环沾取少许待分离的材料，在培养基表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物将随着划线次数的增加而分散，经保温培养形成菌落。划线开始的部分细菌分散度小，形成的菌落往往连在一起。由于连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落。这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。划线法这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。具体方法是将显微镜挑取器（单胞分离器）装置在显微镜上，把一滴细菌悬液置于载玻片上，用显微镜挑取器的极细的毛细吸管，吸取视野中的一个单细胞，再接种培养基上培养。单细胞挑取法不同微生物需要不同的营养物质和环境条件。各种微生物对不同的化学试剂如消毒剂、染料、抗生素及其他物质等具有不同的抵抗能力。“投其所好、取其所抗”，便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到纯种分离的目的。另外，也可以将待分离的样品先进行适当处理，以消除不希望分离到的微生物。选择培养基分离法稀释平板法－－既可定性，又可定量，用途广泛

平板划线法－－方法简便，多用于分离细菌

单细胞挑取法－－局限于高度专业化的科学研究

选择培养基分离法－－适用于分离某些生理类型较特殊的微生物微生物纯培养分离方法的比较微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体的生长很难测定，而且也没有什么实际应用价值。因此，测定它们的生长不是依据细胞个体的大小，而是测定群体的增加量，即群体的生长。细菌的数目就表示了它的生长量。三、微生物生长的测定单细胞微生物数量的测定1.全数测定（1）计数器测定法

用特制的细菌计数器或血球计数器进行计数。取一定容积稀释的单细胞微生物悬液置于计数器载玻片与盖玻片之间的计数室内。由于计数室的容积是己知的(总面积为1平方毫米，高0.1毫米)，并有一定刻度。因此，可根据计数器刻度内的细菌数，计算出样品中的含菌数。（每个小格的容积为1/4000000mL）

每毫升原菌液含菌数=小格的平均菌数×4×106×稀释倍数（2）染色涂片计数法

将已知体积的待测材料，均匀地涂布在载玻片的已知面积上，经固定染色后，在显微镜下计算染色涂片上的细菌数。原理是悬液中细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。测定菌悬液的光密度或透光度可以反映细胞的浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数的悬液相比，可以从已知悬液的稀释倍数，求出未知悬液所含的细胞数。此法比较简便。注意：样品颜色不宜太深；样品中不要混杂其他物质，否则不能使用；同时菌悬液浓度必须在107/毫升以上才能显示可信的混浊度。(3)比浊法

（1）稀释平板法

像稀释平板分离法一样，先将待测菌液作一系列10倍稀释，使平皿上长出的菌落数在30-300个之间。然后将最后三个稀释度的稀释液各取一定量(一般为1毫升)与融化并冷至45℃左右的琼脂培养基一起，倾入无菌平皿中摇匀，静置，待凝固后进行保温培养，通过平皿上出现的菌落数，便可推算出原菌液含菌数。计算公式：总活菌数/毫升=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数

2.活菌测数（2）液体稀释培养法取待测菌液进行一系列的稀释，然后分别取其1mL稀释液做3－5次重复的试管培养，观察菌体生长情况，如有菌生长，培养液发生混浊，由于菌液经多次稀释，所以，菌数随稀释度的增高而减少，在稀释度很高的菌液中菌数极少或无。这样可根据统计学上“或然率”理论计算出细胞的近似数。多细胞微生物的生长，如丝状霉菌的生长通常是以其菌丝生长的长度或菌丝增加的重量作为生长指标。最简单的方法是将霉菌接种在培养皿内固体培养基的中央，在一定时间内测定菌落的直径或面积。缺点是仅能测菌落的直径或面积，不能包括菌落的厚度和生长在培养基内的菌丝，因此不能反映菌丝生长的总量。多细胞微生物生长的测定1.干重法取一定量的培养液，然后用离心或过滤的方法将菌体从培养基内分离出来，经洗净、烘干、称重，求得培养物中细胞的重量，以此作为生长量的指标。一般来说，细菌的干重约为湿重的20-25%。此法较为直接而又可靠，主要用于调查研究。但只适用于菌体浓度较高的样品，而且要求样品中不含非菌体的干物质。细胞物质量的测定

蛋白质是细胞的主要物质，含量比较稳定，而氮又是蛋白质的重要组成。因此测定细胞内含氮量可以表示其生长情况。方法要点：从一定量培养物中分离出细菌，洗涤，以除去培养基带入的含氮物质。再用凯氏定氮法测定总含氮量。一般细菌的含氮量约为原生质干重的14%。而总氮量与细胞蛋白质总含量的关系可用下式计算：蛋白质总量=含氮量%×6.25此法只适用于细胞浓度较高的样品，同时操作过程也较麻烦，故主要用于科学研究。2.含氮量法每种方法都各有优点和局限性。只有在考虑了这些因素同要着手解决的问题之间的关系以后，才能对具体的方法进行选择。将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定细菌含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细菌数量并不增加，随之细菌数目增加很快，继而细菌数又趋稳定，最后逐渐下降。如果以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到一条曲线，称为生长曲线。四、生长曲线根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。细菌的生长曲线图

生长阶段特征延滞期分裂迟缓、代谢活跃。生长速度近于零。延迟期的长短与菌种、种龄、接种量和培养基成分有关。对数期又称指数期。突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加。稳定期新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度又逐渐趋向零。菌体产量达到最高，细胞开始储藏糖原、脂肪等储藏物，产芽孢的开始形成芽孢，开始合成次生代谢产物。衰亡期死亡细胞数目超过新生细胞，细胞形态多样，细胞开始自溶，开始释放次生代谢产物。整个生长过程可以分为4个阶段，各阶段的特点见表代时即单个细胞完成一次分裂所需的时间，也叫增代时间。单细胞微生物，在对数期细胞数按几何级数增加，1→2→4→8→……，若以次方的形式表示，即20→21→22→23→2n。很清楚，这里的指数“n”就是细菌分裂的次数或增殖的代数。如果在时间t0时菌数为x，经过一段时间，到t1时，繁殖“n”代后，菌数为y，则代时(G)可以下式表示：G＝（t1－

t0）／n，Y＝X﹡2nn＝3.3㏒（y／x）例如：设大肠杆菌在接种时的细胞浓度为100个/ml，经400分钟的培养，细胞浓度增至10亿个/ml，求该菌的世代时间和繁殖代数。根据公式G=（t1-t0）/3.3(lgy-lgx)t0为接种的时间x=100t1为培养时间(400分钟)

y=1，000，000，000n=3.3(lg109-lg102)=3.3×7=23.1代入上式G=400-0/23.1=17.3即在上述培养物中，大肠杆菌的代时为17.3分钟，400分钟内共繁殖了23.1代。将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获，此称分批培养(batchculture)。通过对细菌纯培养的生长曲线的分析可知，在分批培养中，培养基一次加入，不予补充，细菌的对数生长期不可能长时间维持。如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢产物)，理论上讲，对数生长期就可无限延长。这种方法就叫连续培养法。四、连续培养(一)恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法叫恒浊连续培养。在恒浊连续培养中装有浊度计，借光电池检测培养室中的浊度(即菌液浓度)，并由光电效应产生的电信号强弱变化，来自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。(二)恒化连续培养控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，培养室中营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率，故称恒化连续培养，又叫恒组成连续培养。第二节环境条件对微生物影响生长是微生物与外界环境因素共同作用的结果。环境条件的改变，在一定限度内，可能上能引起微生物形态，生理、生长、繁殖等特征的改变，当环境条件的变化超过一定极限，则导致微生物的死亡。研究环境条件与微生物之间的相互关系，有助于了解微生物在自然界的分布与作用，也使人们有可能制订增进或降低、甚至完全破坏微生物生命活动的有效措施。介绍几个有关的术语防腐

是一种抑菌作用。用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长、繁殖但又未死亡的状态。消毒

是指杀死或消除病原微生物的措施，可达到防止传染病传播的目的。灭菌是指用物理或化学因子，使非于物体中的所有生活微生物，永久性地丧失其生活力，包括最耐热的细菌芽孢。这是一种彻底的杀菌措施。化疗

是指利用某些具有选择毒性的化学药物(如磺胺)或抗生素，来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，对生物体进行治疗，可以有效地消除宿主体内的病原体，但对宿主却没有或基本上没有损害。一、温度温度是影响有机体生长与存活的最重要的因素之一。微生物生长的温度范围较广，已知的微生物在零下12-100℃均可生长。而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长。各种微生物都有其生长繁殖的最低温度、最适温度、最高温度和致死温度。最低生长温度：是指微生物进行繁殖的最低温度界限，如果低于此温度，则生长完全停止。最适生长温度：能够使微生物迅速生长繁殖的温度叫做最适生长温度，在此温度下，微生物群体生长繁殖速度最快，代时最短。不同微生物的最适生长温度是不一样的。应该着重指出：最适合生长温度不一定是一切代谢活动的最好温度。最高生长温度：是指微生物生长繁殖的最高温度界限。致死温度：最高生长温度若进一步升高，便可杀死微生物，这种致死微生物的最低温度界限即为致死温度，致死温度与处理时间有关。微生物的最适温度类型(1)低温型适宜在10-15℃范围内生长，它们常分布在地球两极地区的水域和土壤中。(2)中温型绝大多数微生物属于这一类。最适温度在25-37℃之间。(3)高温型它们适于在45-50℃以上的温度中生长，常见于温泉、日照充足的土壤表面、堆肥堆、发酵饲料等腐烂有机物中。(1)干热灭菌①焚烧灭菌法此法灭菌彻底，迅速简便，但使用范围有限。常用于接种工具、污染物品以及实验动物尸体等废弃物的处理。②干热灭菌法主要在干燥箱中利用热空气进行灭菌。通常160℃处理1-2小时便可达到灭菌的目的。如果被处理物传热性差、体积较大或堆积过挤时，需适当延长时间。此法只适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。其优点是可保持物品干燥。高温对微生物的影响和利用高温灭菌的方法(2)湿热灭菌①煮沸消毒法物品在水中煮沸(100℃)15分钟以上，可杀死细菌的所有营养细胞和部分芽孢。这种方法适用于解剖用具等的消毒。②间歇灭菌法将待灭菌物品置于蒸锅及其他灭菌器中，常压下100℃处理15-30分钟，以杀死其中的营养细胞。冷却后，置于一定温度(28-37℃)保温过夜，使其中残存的芽孢萌发营养细胞，再以同样方法加热处理。如此反复三次，可杀灭所有芽孢和营养细胞。此法的缺点是灭菌较费时，一般只用于不耐热的药品、营养物等的灭菌。高温灭菌的方法③巴斯德消毒法即用较低的温度处理牛奶、酒类等饮料，以杀死其中的病原菌如结核杆菌、伤寒杆菌等，但又不损害营养与风味。如用62-63℃则处理30分钟，若以71℃，只需15秒钟。这种方法只能杀死大多数腐生菌的营养体而对芽孢无损害。此法是基于结核杆菌的致死温度62℃15分钟而规定的。这种消毒法系巴斯德发明，故称巴斯德消毒法。④高压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌法是实验室及生产中常用的灭菌方法。适用于各种耐热物品的灭菌。常采用1千克/厘米2(15磅/英寸2)的蒸汽压，121℃的温度下处理15-30分钟，即可达到灭菌的目的。灭菌所需时间和温度取决于被灭菌物品的性质、体积与容器类型等。对体积大、热传导性较差的物品，加热时间应适当延长。

蒸汽热穿透力强，可迅速引起蛋白质凝固变性。所以高压蒸汽灭菌在湿热灭菌法中效果最佳、应用较广。当温度低于最低温度范围，微生物代谢活动降低，接近于停止状态，但原生质结构通常并未破坏，不至于很快死亡，它可在一个较长的时间内保存其生活力，当温度提高后，仍可恢复其正常生命活动。低温保存菌种的方法，就是利用这个原理。一般说来，微生物在干燥和真空的条件下可保持较长期的存活力。低温对微生物的影响二、氧气好氧菌兼性厌氧菌厌氧菌耐氧菌微好氧菌三、pHpH值表示某水溶液中氢离子浓度的负对数值。不同种类微生物有其最适生长pH外，即使同一种微生物在其不同生长阶段和不同的生理、生化过程，也有不同的最适pH。微生物的生命活动过程中会能动的改变外界环境的pH，这是培养基的原始pH在培养微生物的过程中会时时发生改变的原因。四、湿度水分是微生物生命活动中的基本物质之一。干燥能引起微生物细胞内蛋白质的变性和盐类浓度的增高，这是抑制微生物生长或促进其死亡的主要原因。食品工业中用干燥法将食品制成干制食品，可以达到保藏的目的。微生物的细胞表面有一层半渗透膜，它使细胞具有一定的渗透压力，能调节细胞内外的渗透压，使其平衡。高渗透压下，细胞质壁分离低渗透压下，细胞吸收膨胀等渗透压下，细胞代谢正常五、渗透压辐射是指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一地方的能源。它们或是离子或是电磁波。电磁辐射包括可见光、红外线、紫外线、X射线和γ射线等。光量子所含能量随不同波长而改变，一般波长愈长，则所含能量愈低，反之则高。六、辐射(1)紫外辐射

紫外线是非电离辐射，以波长265-266纳米的杀菌力最强。紫外辐射对微生物有明显的致死作用，是强杀菌剂。由于紫外线穿透能力差，不易透过不透明的物质，故紫外杀菌灯只适用于空气及物体表面消毒。紫外辐射的杀菌机制是复杂的，现知主要是由于它对DNA的作用，最明显的是形成胸腺嘧啶二聚体。经紫外辐射处理后，受损伤的微生物细胞若再暴露于可见光中，一部分可恢复正常，称光复活现象。

X射线与α射线、β射线和Υ射线均为电离辐射。在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。它们的波长很短，有足够的能量从分子中逐出电子而使之电离。换句说，电离辐射的杀菌作用不是靠辐射直接对细胞作用，而是间接地通过射线引起环境中水分子和细胞中水分子在吸收能量后导致电离所产生的自由基起作用。这些游离基团能与细胞中的敏感大分子反应并使之失活。电离辐射效应无专一性。常用于一次性塑料制品的消毒，也用于食品的消毒。(2)电离辐射超声波(频率在20000赫兹以上)具有强烈的生物学作用。超声波的作用是使细胞破裂，所以几乎所有的微生物都能受其破坏，其效果与频率、处理时间、微生物种类、细胞大小、形状及数量等均有关系。一般来说，高频率比低频率杀菌效果好，球菌较杆菌抗性强。细胞芽孢具更强的抗性，大多数情况下不受超声波影响。七、超声波超声波致死微生物是引起细胞破裂，内含物外溢，因此，科研中常用此法破碎细胞，以研究其化学组成及结构，发细胞结构、抗原结构和酶的活性等。八.某些化学物质1、重金属及其化合物大多数重金属及其化合物都是有效的杀菌剂或防腐剂。其作用最强的是Hg、Ag和Cu。它们的杀菌作用，有的易与细胞蛋白质结合而使之变性；有的在进入细胞后与酶上的-SH基结合而使酶失去活性。从而抑制微生物的生长或导致死亡。

汞汞化合物有二氯化汞(HgCl2)、氯化亚汞(Hg2Cl)、氯化汞(HgCl)和有机汞。二氯化汞又名升汞，是杀菌力极强的消毒剂之一，1∶500-1∶2000的升汞溶液对大多数细菌有致死作用，实验室中曾用0.1%的HgCl2消毒非金属器皿。由于汞盐对金属有腐蚀作用，而且对人及动物有剧毒，其应用受到较大的限制。现已合成了许多汞有机化物，如硫柳汞等。毒性较低。红汞(汞溴红)也是最常用的消毒剂之一。银

长期来作为一种温和防腐剂而被使用。0.1-1%硝酸银(AgNO3)用于皮肤消毒。新生婴儿常用1%硝酸银滴入眼内以预防传染性眼炎。蛋白质与银或氧化银制成的胶体银化物，刺激性较小，也可作为消毒剂或防腐剂。铜

硫酸铜是主要的铜化物杀菌剂，对真菌及藻类效果较好。在农业上为了杀伤真菌、螨以至防治某些植物病害，常用硫酸铜与石灰以适当比例配制成波尔多液使用。酚又名石炭酸。它们对细菌的有害作用可能主要是使蛋白变性，同时又有表面活性剂的作用，破坏细菌膜的透性，使细胞内含物外溢。当浓度高时是致死因子，反之则起抑菌作用。例如：0.5-1%的水溶液可用于皮肤消毒，但具刺激性；2-5%的溶液可用于消毒痰、粪便与用具；3-5%的溶液有很好的杀菌效果；5%的则用作喷雾以消毒空气。芽孢与病毒比细菌营养细胞的抗性强，细菌的芽孢在5%的石炭酸溶液中仍可存活几小时。2、酚及其衍生物甲酚酚的衍生物，杀菌力比酚强几倍。甲酚在水中的溶解度较低，但在皂液与碱性溶液中易形成乳浊液。市售的消毒剂煤酚皂液(来苏尔)就是甲酚与肥皂的混合液，常用3-5%的溶液来消毒皮肤、桌面及用具等。它是脱水剂、蛋白质变性剂，也是脂溶剂，可使蛋白质脱水、变性，损害细胞而具杀菌能力。50-75%的乙醇便可杀死营养细胞；75%的乙醇杀菌效果最好，超过75%以至无水酒精效果较差。无水乙醇可能与菌体接触后迅速脱水，表面蛋白质凝固，形成了保护膜，阻止了乙醇分子进一步渗入。使用时应根据消毒物品干燥与否来确定使用浓度。乙醇是普遍使用的消毒剂，常用于实验室内的玻棒、玻片及其他用具的消毒。3、醇甲醇的杀菌力较乙醇差，而且对人，尤其是对眼睛有害，不适于作消毒剂。醇类物质，随着分子量的增大，杀菌力增强。例如戊醇＞丁醇＞丙醇＞乙醇＞甲醇。那些高级醇虽杀菌力强于乙醇，由于丙醇以上的醇不易与水相混，故一般不用作消毒剂。甲醛也是一种常用的杀细菌与杀真菌剂，效果良好。纯甲醛为气体状，可溶于水，市售的福尔马林溶液就是37-40%的甲醛水溶液。由于甲醛具有腐蚀性而且刺激性很大，不宜人体使用，一般用10%的溶液进行熏蒸以消毒厂房、无菌室或者传染病患者的家具、房屋等。甲醛既有杀菌作用又有抑菌作用，也不受有机物质的影响。4、甲醛碘

是强杀菌剂。3-7%碘溶于70-83%的乙醇中配制成碘酊，是皮肤及小伤口有效的消毒剂。碘一般都作外用药。据试验，1%的碘酒或1%碘甘油溶液，10分钟内可杀死一般的细菌和真菌，并使病毒灭活。关于碘的杀菌机制还不清楚，有人认为，它的作用可能是碘不可逆地与菌体蛋白质(或酶)中的酪氨酸