J第七章分子荧光分析法

一、

荧光分析的基本原理

二、荧光分析仪

三、分子荧光分析法及其应用

第七章

分子荧光分析法

molecularfluorescenceanalysis

荧光的发现植物愈创木切片黄色水溶液——天兰色荧光；第一节概述荧光的发现1928：Jette和West第一台光电荧光计1952：第一台商品化的荧光分光光度计特点：1)灵敏度高（1-100ppb)：有的可达0.01ppb；2)选择性强；3)方法简单快速，用样量少;4)提供比较多的物理参数。概述

某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物

萤石(fluospar)而得名。

紫外荧光、可见荧光红外荧光、X射线荧光用荧光抗体染色之原生动物澳大利亚科学家最新发现，一种叫“螳螂虾”的海里动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者或者吸引性配偶，

K.Brejcet.al.,PNAS94(1997)23061nmgreen-fluorescentprotein(GFP)一、分子荧光化合物分子吸收电磁波并发射出另一波长电磁波二、分子荧光分析法利用物质分子的荧光进行分析测定的方法lex、I0lem、Iflex、I激发光发射光透射光什么结构的化合物具有分子荧光？——基本原理分子荧光如何测量？——荧光分光光度计分子荧光法有何应用？——分子荧光分析法应用概述第一节基本原理一、分子荧光的产生二、激发光谱和发射光谱三、分子荧光与浓度间的关系四、影响荧光强度的因素第一节基本原理一、分子荧光的产生1.电子激发态的多重度电子激发态的多重度：M=2S+1

S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；大多数有机分子的基态处于单重态；S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫

3.激发态→基态的能量传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

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2T2内转换振动弛豫S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

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2T2内转换振动弛豫

3.激发态→基态的能量传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁第一节基本原理一、分子荧光的产生S0S1S2T1激发单重态激发三重态激发光谱和发射光谱

激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）

激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！

发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？吸收池光源检测器单色器信号显示系统单色器荧光光谱的形状与激发波长无关。

原因！

发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；

‘2>2>1

荧光：10-7～10-9

s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；3.荧光光谱的特征

a.Stokes位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长b.发射光谱的形状与激发波长无关

c.与激发光谱呈镜像关系通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。

ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1c.镜像规则

通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等分子荧光产生的必备条件三、分子荧光与浓度间的关系分子必须能够吸收激发光分子必须具有一定的荧光量子产率与激发态分子失活过程的速率常数有关发射过程中的速率常数其他过程有关的速率常数，主要取决于环境1.荧光量子产率2.分子荧光与浓度间的关系A≤0.05若

稀溶液一、

荧光分析的基本原理

二、荧光分析仪

三、分子荧光分析法及其应用

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分子荧光分析法

molecularfluorescenceanalysis

第一节基本原理一、分子荧光的产生二、激发光谱和发射光谱三、分子荧光与浓度间的关系四、影响荧光强度的因素激发态→基态的能量传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁第一节基本原理一、分子荧光的产生S0S1S2T1激发单重态激发三重态激发光谱和发射光谱

吸收池光源检测器单色器信号显示系统单色器

发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；

‘2>2>1

荧光：10-7～10-9

s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；3.荧光光谱的特征

a.Stokes位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长b.发射光谱的形状与激发波长无关

c.与激发光谱呈镜像关系通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。

ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)

稀溶液三、分子荧光与浓度间的关系1.荧光量子产率第一节基本原理一、分子荧光的产生二、激发光谱和发射光谱三、分子荧光与浓度间的关系四、影响荧光强度的因素（1）跃迁类型（2）共轭效应（3）取代基效应（4）结构刚性效应四、分子荧光与分子结构的关系n振动弛豫激发

n荧光（1）跃迁类型跃迁是产生荧光的主要跃迁类型较大的摩尔吸光系数较短的激发态寿命10-7~10-9s系间窜越至三重态几率小产生荧光的物质:芳香族化合物含脂肪族和指环族羰基结构的化合物稠环化合物苯环被稠化至杂环核上的杂环化合物（2）共轭效应共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。0.070.180.930.27化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.521）给电子取代剂加强荧光（3）取代基效应—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN产生p→π共轭二苯甲酮：弱荧光、强磷光S1→T1的系间窜跃产率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相对荧光强度10182020202）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光—C=0，—COOH，—NO2不产生p→π共轭硝基苯：不产生荧光、弱磷光化合物荧光相对强度苯10苯酚18苯胺20苯甲酸3硝基苯0空间位阻对荧光发射的影响3）取代基的位置反式二苯乙烯强荧光物质F=0.75F=0.03立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。4）重原子取代基效应—Cl，—Br，—IS1→T1的系间窜跃由于重原子的存在增强（4）结构刚性效应（1）跃迁类型（2）共轭效应（3）取代基效应（4）结构刚性效应2.分子荧光与分子结构的关系五、影响荧光强度的主要因素

1.溶液荧光的猝灭2.溶剂的影响3.温度的影响4.溶液pH的影响1.荧光猝灭荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。

荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。

溶液荧光猝灭的主要原因1）静态猝灭2）动态猝灭浓度限量1g~1mg/ml荧光猝灭法：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系测定荧光猝灭剂含量的方法。

3）荧光物质自猝灭2）溶剂对荧光强度的影响极性增加，荧光光谱红移，荧光产率增加；粘度增加，荧光产率增加一般溶剂效应：介电常数，折射率。普遍存在特殊溶剂效应：形成氢键溶剂相对介电常数荧光峰/nm荧光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率3）温度对荧光强度的影响随着温度的增高，荧光物质溶液的荧光量子产率及荧光强度将降低不同温度下邻菲啰啉的

荧光光谱（在邻二苯中）碰撞几率增大粘度降低pH<2无荧光7~12蓝色荧光>13无荧光

4）介质酸度的影响五、影响荧光强度的主要因素

1.溶液荧光的猝灭2.溶剂的影响3.温度的影响4.溶液pH的影响第二节基本原理一、分子荧光的产生光致激发非辐射跃迁失活辐射跃迁二、激发光谱和发射光谱三、分子荧光与浓度间的关系A≤0.05四、影响荧光强度的因素1.荧光与分子结构的关系跃迁类型、共轭、刚性平面、取代基2.影响荧光强度的主要因素荧光猝灭、温度、pH、溶剂激发光源(lightsource)

样品池(吸收池)(absorptioncell)单色器(monochromator)检测器(detecor)记录及数据处理器(display)

一、仪器的主要部件

7-3荧光分析仪器光源1.光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命2.氙灯光源常用气体放电灯类型：氙灯光源高压汞光源波长范围：200~1000nm工作压力：5~20atm启动电压：20~40KV使用寿命：1000~2000h最广泛应用的连续光源：发射波长范围宽发射光强度大样品池紫外-可见分光光度计

测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池（液池）I0ItI0ItIF,p滤光片、棱镜、光栅单色器混合光单色光狭缝狭缝色散原件准直镜光电池或光电倍增管,光电二极管阵列式检测器检测器二、荧光光谱仪吸收池光源检测器单色器信号显示系统二、荧光光谱仪基本结构单色器问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制荧光(磷光)分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别

紫外-可见分光光度计荧光分光光度计光路光源仪器校正吸收池入射光与吸收光同方向入射光与荧光垂直方向两种光源(紫外+可见)一种光源(紫外)空白溶液(F=0)荧光对照品溶液(F=100%或50%)空白溶液(T=100%)紫外无吸收两面透光低荧光材料四面透光7-4荧光分析法的应用一、荧光分析法的特点（1）信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子产率、荧光寿命等。（2）选择性强（3）试样量少，应用范围广。（4）灵敏度高分析物浓度范围：10-5～

10-8mol/L，检测下限：0.1～0.001g/mL比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级。

定性方法特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧光定性分析的基础。定量方法

If

=2.3I0bc

=Kc二、定性、定量方法1.标准曲线法直接荧光标准曲线法FCsFxCx2.比较法3.荧光分析注意事项1）防止荧光污染2）防止散射光的干扰三、荧光分析法的应用1.直接测定和间接测定

直接测定：被测物质本身发生荧光间接测定：被测物质本身不发荧光或荧光量子产率很低。①衍生化法；②荧光猝灭法三、荧光分析法的应用1.无机物分析：采用间接法（1）与有机试剂形成配合物后测量Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr（2）通过其对荧光试剂的荧光增强或猝灭效应进行测定。CN-、F-与Al、Zr离子强烈配合→使原有荧光配合物的荧光猝灭。目前可测量元素已有约60多种。