实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术第一页，共六十页，2022年，8月28日内容概要荧光定量PCR的基本概念荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法

SYBR法实验流程及注意事项第二页，共六十页，2022年，8月28日常规PCR与实时荧光定量PCR常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析第三页，共六十页，2022年，8月28日荧光定量PCR常用的三个概念扩增曲线荧光阈值CT值第四页，共六十页，2022年，8月28日Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件扩增曲线第五页，共六十页，2022年，8月28日Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光阈值平台期第六页，共六十页，2022年，8月28日Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）Rn（荧光强度）CtvalueCt值Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性第七页，共六十页，2022年，8月28日Ct值的数学原理理想的PCR反应：Xn=X0×2n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:

logXn=log[X0(1+Ex)n]

整理方程式得:logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：

logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+

logXc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率第八页，共六十页，2022年，8月28日CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration

模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。

Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。Ct值与模板起始量的关系第九页，共六十页，2022年，8月28日qPCR常用实验方法简单成本较低适用于多重PCR特异性较好可进行SNP检测特异性非常好ABC第十页，共六十页，2022年，8月28日SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料SYBRGreenI第十一页，共六十页，2022年，8月28日热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——作用机理第十二页，共六十页，2022年，8月28日问题点：

SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBRGreenI染料法——问题点与关键点关键点：

设计合适引物，防止非特异性扩增！第十三页，共六十页，2022年，8月28日将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱SYBRGreenI染料法——融解曲线第十四页，共六十页，2022年，8月28日融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确SYBRGreenI染料法——融解曲线第十五页，共六十页，2022年，8月28日

使用方便，不必设计复杂探针具有价格优势优点

无模板特异性对引物特异性要求较高不能进行多重定量灵敏度相对较低缺点SYBRGreenI染料法——优缺点第十六页，共六十页，2022年，8月28日Taqman探针法——原理

5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)

探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针第十七页，共六十页，2022年，8月28日Taqman探针法——工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物第十八页，共六十页，2022年，8月28日1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：

一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度

3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：100-900nM

探针浓度：50-300nM4、其他与常规PCR相同Taqman探针法——PCR体系的建立第十九页，共六十页，2022年，8月28日

高度特异性重复性好灵敏度高可进行多重定量优点

只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点Taqman探针法——优缺点第二十页，共六十页，2022年，8月28日

标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂实时荧光定量PCR的分类－－分子信标第二十一页，共六十页，2022年，8月28日FRET实时荧光定量PCR的分类——分子信标第二十二页，共六十页，2022年，8月28日高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优点

只能用于一个特定目标设计困难价格比较高缺点实时荧光定量PCR的分类——分子信标第二十三页，共六十页，2022年，8月28日

几种方法的应用比较方法优点缺点适用范围SYBRGreenI适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断MolecularBeacon高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析第二十四页，共六十页，2022年，8月28日绝对定量标准曲线由已知浓度的RNA、质粒生成定量未知模板标准样品和未知样品必须同时反应相对定量

CtMethod:使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因，参照基因可以与目的基因同时反应，也可以单独反应。双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。绝对定量vs相对定量第二十五页，共六十页，2022年，8月28日Sample25绝对定量

Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系

根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量第二十六页，共六十页，2022年，8月28日一个目的基因

——即需要确定其量值的核酸序列。一组标准样本

——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。重复反应孔

–——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。标记方法的选择——SYBRGreen法或探针法均可。实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。绝对定量分析几要素第二十七页，共六十页，2022年，8月28日拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014

倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算第二十八页，共六十页，2022年，8月28日

方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测

试剂：RealMasterMix（Probe）

标准品：质粒标准品浓度为106、105

、104

、103

；2个重复；设阴性空白对照

实验步骤：提取HBVDNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数。绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量第二十九页，共六十页，2022年，8月28日Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD标准品5×10328.1828.6428.410.16标准品5×10425.2525.1425.190.04标准品5×10522.1122.4622.280.12标准品5×10618.6318.9218.770.10未知样品?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone实验数据乙肝病人血液中HBV的绝对定量第三十页，共六十页，2022年，8月28日扩增效率（E）计算

E=10-1/slope

－1=10-1/-3.29

－1

=2.01－1=1.01标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.29x+40.33R2=0.9978乙肝病人血液中HBV的绝对定量

相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.9-1.1,越接近1，越理想。第三十一页，共六十页，2022年，8月28日未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5=-3.29X+40.33QuantityUnknown=106.03

=1,071,519copies乙肝病人血液中HBV的绝对定量X=20.5-40.33-3.29=6.03第三十二页，共六十页，2022年，8月28日理论上目的基因表达量分析条件SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析相对定量的必要性第三十三页，共六十页，2022年，8月28日一个参照样本一个或一个以上的未知样本一个目的基因管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量重复反应孔

–——建议每个样本设置三个或三个以上重复孔，以确保统计结果的可信度。标记方法的选择——SYBRGreen法或探针法均可。实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。一组标准样本（有些分析方法不需要）相对定量分析几要素第三十四页，共六十页，2022年，8月28日管家基因

维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等筛选方法

根据文献提供通过具体实验筛选相对定量分析——管家基因筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

第三十五页，共六十页，2022年，8月28日

双标准曲线法

2-△△Ct法

相对定量分析方法第三十六页，共六十页，2022年，8月28日相对定量分析实例分析利用TaqMan法研究ERBB2在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异已知在50%的乳腺肿瘤样本中,ERBB2表达异常,因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因FAM标记的ERBB2探针VIC标记的GAPDH探针构建标准曲线双重PCR反应阴性对照无RNA对照（空白）无逆转录酶对照（基因组）第三十七页，共六十页，2022年，8月28日双标准曲线法Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2第三十八页，共六十页，2022年，8月28日样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH肿瘤肿瘤正常正常第三十九页，共六十页，2022年，8月28日双标准曲线法——实验结果MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0426.24±0.17ERBB2表达MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8628.34±0.1026.83±0.03GAPDH表达第四十页，共六十页，2022年，8月28日HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/µlTotalRNAERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011=1.6300.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression双标准曲线法——结果分析第四十一页，共六十页，2022年，8月28日ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.18结果与双标准曲线法相近HealthyRNABBER2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43±0.0428.34±0.105.18±0.18CarcinomaRNABBER2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1726.83±0.034.41±0.212法——实验结果－△△Ct第四十二页，共六十页，2022年，8月28日样品制备环境要求定量体系配备数据分析RT上机浓度确定SYBR法实验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具纯度高、完整性好的RNA分光光度计检测电泳检测第四十三页，共六十页，2022年，8月28日cDNA的合成反应体系优化试剂选择样品制备定量体系配备数据分析上机AMVM-MLVQuant下游反应数确定反转录体积引物的选择高效、全长的cDNASYBR法实验流程及注意事项第四十四页，共六十页，2022年，8月28日cDNA合成(两步法qRT-PCR)qPCR关键cDNA影响qPCR敏感度全长cDNA合成增加qPCR成功率引物Oligo(dT):只识别mRNA，合成cDNA序列靠近3’随机引物:随机合成序列，可能合成非编码RNA，造成定量结果高估两者混合结合两者优点好的qPCR结果依赖于成功的cDNA合成第四十五页，共六十页，2022年，8月28日定量体系配备引物设计浓度确定环境要求误差控制RT样品制备数据分析上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间使用mix降低系统误差设置重复（≥3次）设置空白和阴性对照均一的反应液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃单个碱基重复＜4个无二级结构扩增长度：100－200bp第四十六页，共六十页，2022年，8月28日维基百科/google输入待查基因名称选择物种mRNA找出目的mRNA输入要查找的蛋白或是基因名称NCBICOPY名称到NCBI重新检索目的mRNA序列文献Real-TimePCR引物序列Blast确定引物特异性引物设计第四十七页，共六十页，2022年，8月28日SYBR引物设计原则SYBR-Green引物引物长度18-30bp，产物长度范围100~400bpG/C含量:40-60%避免引物内含有互补序列(尤其是3’端)避免3’端错配3’端不能出现连续三个以上的G或C避免3’端出现T碱基设计夸内含子引物第四十八页，共六十页，2022年，8月28日TaqMan探针和引物设计TaqMan探针

-Tm值比引物高10℃

-没有连续相同的碱基

-探针位置尽可能地靠近上游引物

-C远远多于G-5‘端没有GTaqMan引物

-Tm(58-600C)

-15-30basesinlength

-G+Ccontent30-80%

-不要有连续4个G

-3’端不能有连续两个以上的G+C

-5‘端不要有G(AorCpreferred)-引物之间的TM相差避免超过2℃

-扩增长度50-150bp(max400)

-引物跨越内含子第四十九页，共六十页，2022年，8月28日免费的基于网络的设计软件Primer5（）-引物和双标记水解探针的设计-Tm的计算MFold（）-引物和扩增产物二级结构的预测-二级结构的稳定性(deltaG)和融解温度(Tm)BLAST（）-结构特异性第五十页，共六十页，2022年，8月28日对照设置阴性对照Negativecontrol:Notemplate(NTC)：检验是否有模板污染Noreversetranscriptase(NRT):检验RNA样品中是否有DNA污染Noamplificationcontrol(NAC):检验是否有聚合酶污染Noprobecontrol(NPC):检验荧光污染Buffer:Onlycontainsbuffer:检验背景荧光阳性对照Calibrator:可以用带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；质粒DNA；克隆到质粒的cDNA；体外反转录的RNA；ReferenceRNApools；来自于特定的生物体样本的RNA或DNA及国际上公认的生物学标准物。Standardcurve第五十一页，共六十页，2022年，8月28日反应体系优化上机反应条件优化cDNA的合成样品制备模板准备数据分析退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定反应体积＞5ul，推荐20－50ul引物浓度优化，模板量优化Mg2＋调节，酶活调节重复性扩增效率：90％－110％：std＜0.2标准曲线：R＞0.99或R2

＞0.98SYBR法实验流程及注意事项标准品待测样本阳性对照阴性对照第五十二页，共六十页，2022年，8月28日技能要求误差控制仪器介绍上机（qPCR）试剂选择cDNA的合成样品制备模板准备数据分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGs