生物大分子分离纯化技术

《生物大分子分离纯化技术》生物大分子制备基本技术第一章概述生物大分子：蛋白质酶核酸是生命现象基本体现者。是一切生命活动的主要物质基础。

生物大分子的制备是一件十分细致的工作，涉及物理学、化学和生物学等多学科的知识。生物大分子、不能熔化、蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相。

一、分离原理：

1.利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中。如盐析、有机溶剂抽提、层析、结晶等。2.将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分配于不同区域而达到分离目的。如离心、电泳、超滤等。二、生物大分子分离、纯化方法类型

性质 具体方法 分子大小和形态差速离心、超滤、分子筛、透析溶解度盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配、结晶电荷差异电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析、吸咐层析生物功能专一性亲和层析色谱吸附＋＋＋＋＋＋＋＋分配＋＋＋＋＋＋＋＋＋离子交换树脂＋＋＋＋＋＋－＋多聚糖±＋＋＋＋－分子筛＋＋＋＋＋±气相＋＋＋＋＋＋＋＋＋逆流分配＋＋＋＋＋＋＋＋＋电泳

自由溶液＋＋＋＋＋＋＋聚乙烯介质＋＋＋＋＋＋＋纤维素＋＋＋＋＋＋－凝胶＋＋＋＋＋＋±±等电聚焦±＋＋＋－－沉降＋＋＋＋－±膜穿透（透析）和扩散＋＋＋＋＋±±溶解度＋＋＋＋＋＋＋＋＋方法分子大小分子电荷分子相互作用氢键结合疏水键结合

以溶质物理性质为基础的各种分离方法

生化分离方法分类表

分离方法

推动力F1

阻滞力F2占优势的作用力分离主要的依据一．色谱（a）吸附

（b）离子交换

（c）分配

（d）分子筛二．逆流分配三．电场力（a）在自由溶液中（b）在多孔支持物中

（c）在凝胶支持物中

（d）等电聚焦（e）对流电泳

（f）电渗析

四．扩散方法（a）透析（b）超滤（c）在溶液中热扩散

五．结晶

六．沉降（a）动力学的（b）等密度的

流体动力

流体动力

流体动力

流体动力机械作用

静电引力静电引力

静电引力

静电引力静电引力电动力静电引力

电动力渗透力流体动力温度梯度重力结晶格子能

重力、离心力离心力

表面能，范德瓦氏力位阻效应

静电引力，极化度分子筛效应

扩散，偶极作用，缔合和解离效应渗透作用,渗透，缔合和解离效应

分子摩擦力，极化度动电作用分子摩擦力，极化度动电作用，表面能分子筛效应

分子摩擦效应

分子筛效应

电动力分子筛效应分子筛效应，表面能（吸附）分子摩擦效应

扩散

分子摩擦效应

F2

F2

F2

F2F2

F1F1

F1和F2

平衡作用F1

F1和F2

F2F2F2

F1

F1平衡作用

极性、位阻因素离子性质分子大小极性因素

分子大小极性因素

离子性质离子性质

离子性质分子大小离子性质离子性质

分子大小离子性质

分子大小分子大小分子大小

分子大小形状

分子大小分子大小介质密度

（细胞外液）

（细胞内液）发酵液→预处理→细胞分离→细胞破碎→碎片分离→提取→精制→成品制作

加热过滤匀浆法离心沉淀（重结晶）浓缩调pH离心研磨法双水相吸附离子交换干燥絮凝膜分离酶解法膜分离萃取色谱分离无菌过滤超滤膜分离成型结晶

图1-1生物工业下游技术一般工艺过程

三．生物大分子的制备过程一般可分为五个阶段（1）材料的选择和预处理（2）细胞的破碎及固液的分离（3）提取（4）纯化（包括盐析、有机溶剂沉淀、有机溶剂抽提、层析、超离心、结晶）（5）浓缩、干燥及保存

生物体内某一组份，特别是未知结构的组份的分离制备设计，大致可分为五个基本阶段：1.确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法。2.制备物物理化学性质稳定性的预备试验。3.材料处理及抽提方法的选择。4.分离纯化方法的摸索。5.获得制备物以后，均一性的测定。

分离纯化是整个生化制备过程的核心部分。生物体的组成成分千千万万种，分离纯化的实验方案也千变万化。没有一种分离纯化方法可适用于所有物质的分离纯化，一种物质也不可能只有一种分离纯化方法。所以对于某一种物质，究竟选用什么分离纯化方法最理想，主要是根据该物质的物理化学性质和具体实验条件而定。认真参考借鉴前人经验可以避免许多盲目性，节省实验摸索时间。即使是分离一个新的未知组分，根据分析和预试验的初步结果，参考别人对类似物质分离纯化经验，也可以帮助少走弯路。

分析鉴定方法指导生物大分子分离制备工作的分析鉴定方法大致可分为三种类型：1.生物学测定方法2.理化测定方法3.理化方法与生物学方法结合测定1.生物学测定方法

对一个未知结构的新物质，生物学测定方法常常比一般理化学方法具有更大优越性，且是实验取得成功必不可少的一步，生物测定方法全面涉及生物学个科的实验内容，如微生物学、细胞学、生理学、组织解剖学、药理学及动植物形态分类学等。生物测定方法很多，而且每一测定方法具体规定标准及条件各不相同，其详细内容的介绍可参看有关专著及资料。生物测定方法虽有很高特异性，但手续繁琐，对于指导分离制备实验的进行，时间上太受限制。2.理化测定方法

这是最常用最方便的分析测定方法，因此，对于一个未知化学结构的物质，如生物反应测定确定其存在后，应立即着手建立理化测定方法。理化测定方法的建立一般是先进行预试，初步肯定该物质属于哪一类有机物，然后按各类有机物质的特殊物理化学性质建立定性、定量鉴定方法，这类方法常有：（1）呈色法：包括染色和比色法。（2）色谱法：包括纸上色谱、薄层色谱、气相色谱和高效掖相色谱等。（3）光谱法：包括紫外光谱、红外光谱、荧光光谱等。（4）电泳法：包括纸电泳、凝胶电泳等。（5）核磁共振波谱法。（6）其他：如电子显微镜观察。理化测定方法的最大优点是实验操作简便快速，能及时指导分离制备工作。3．理化方法与生物学方法结合测定

对于某些生物体内含量较低，或所建立的理化测定方法的特异性和灵敏度不足以反映该物质定性与定量的要求时，常需要结合生物学测定方法才能全面地准确地反映该物质的存在情况。理化分析方法与生物学测定方法相结合，用于各类抗菌素、信息素、激素、维生素和各种具有生理活性的生化药物的定性及定量相当普遍。

制备物均一性的鉴定

对一个新分离的物质是否纯，常用“均一性”表示，均一性即指所获得的制备物只具有一种完全相同的成分。蛋白质均一性常用的几种鉴定方法：1.溶解度法：2.电泳均一性的测定法：3.高速离心沉淀法：1.溶解度法：这是主要根据Gibb相律理论而建立的一种经典方法。Gibb相律理论认为，一个单一成分的物质在一定条件下其溶解度是一定的。因此，当某一物质在溶剂中的溶解度达到饱和时，其溶解曲线有着非常明显的转折点。在实际应用时，常选择几个不同PH和离子强度的条件进行，使所得结果更加准确。溶解度测定法操作简单，方法也很灵敏。它不仅用于蛋白质，也可用于其他物质的纯度测定。但因需要大量的样品，现在已很少应用。2.电泳均一性的测定法：早期在自由溶液中，测定在不同PH及离子强度条件下带电物质的电泳迁移率，以表示电泳的均一性，但在实际操作中常存在许多影响因素，难以达到理想程度。前沿电泳法则主要由于分辨率较低及使用的仪器和操作都比较复杂，所以使用的人不多。此外，以上两种方法样品用量也比较多，故已渐渐被凝胶电泳所代替。凝胶电泳不仅具有电泳作用，同时还具有分子筛作用。因此有极高的分辨能力。如SDS可以检测出10-9至10-12克样品的含量，含量10-15微克分子的蛋白质或5-10微克左右的核酸在一定的PH下能做出很漂亮的均一性实验结果。凝胶电泳在测定样品均一性的同时，还可以分析鉴定样品分子大小和形状。是目前许多生物大分子普遍采用的均一性鉴定的方法。用凝胶电泳进行蛋白质均一性测定时，一般都需要变换二至三种PH值进行实验，才能对所得结果是否均一加以评定.近年来，还发展了各种免疫电泳和最近流行专门检验糖蛋白使用的亲和电泳。它们都是由凝胶电泳衍生出来的。具有更专一，操作更简便的优点。3.高速离心沉淀法：是一个测定蛋白质及其他生物大分子均一性的经典方法，在理论上这一方法是完善的。主要问题是离心设备本身的缺陷，以至每个组分在离心管中所能移动的距离很短。如果每个组分的分子大小、形状、带电性质差别不大时，由于影响分子移动的各种因素综合平衡的结果，往往使各组分所受的力场作用相等，于是就很难区分。所以使用高速离心沉降方法测定物质的均一性，其精确度的提高受到一定限制。但由于其具有测定时间短，样品用量少等优点，现仍是经常使用的方法之一。A：溶解性能

1.在水或各种稀盐溶液中的溶解性能；2.在弱极性溶剂中溶解性能（如甲醇、乙醇、丙酮等）3.在各种非极性溶剂中的溶解性能（如氯仿和各种烃类等）B：溶液稳定性

1.PH稳定范围2.温度效应3.各种缓冲溶液的影响4.有机溶剂（如乙醇、丙酮等）的影响C：固态时稳定性1.温度影响；2.水分含量的影响；3.低压冻干效应D：物理性质

1.透过不同大小孔径膜的能力；2.在固体上的吸附作用；3.在电场中每一PH变化的迁移值；4.在超离心力场中的沉淀作用。E：化学性质

1.对胰蛋白酶及其他蛋白水解酶作用的稳定性；2.对Dnase和Rnase作用的稳定性；3.对糖类分解酶作用的稳定性；4.在温和条件下乙酰化作用的稳定性；5.对亚硝酸作用的稳定性；6.在温和条件下酯化作用的稳定性。四.生物大分子分离制备方法的特点

（1）生物材料组成非常复杂。一种生物材料常包括数种甚至数千种化合物，各种化合物的形状，大小、分子量和理化性质都不相同，其中有些分子化合物至今还是未知物质，而且在分离时仍在代谢变化中。

（2）有些化合物在材料中含量极微。

1/万—1/100万。

（3）许多具有生物活性的化合物稳定性差。

一旦离开了生物体内的环境，很易失活。因此，在分离过程中要十分小心保护这些化合物的生理活性。

（4）生物大分子的分离方法经验性强。实验几乎都在溶液中进行，各种参数（T、pH值、离子强度）构成的综合影响常常无法固定，以致许多实验的设计理论性不强，实验结果常常有很大经验成份。因此，一种分离技术的建立，从材料到方法直至各种环境条件，使用的试剂药品等都必须严格地加以规定。（5）生物大分子分离方法多采用温和的“多阶式”方法进行。

一个生物分子的分离制备常常少则几个，多至十几个步骤，并不断变换各种分离方法，以达到纯化目的。（6）对其均一性的评定常常是有条件的，与化学上纯度的概念并不完全相同。（7）严格防止污染。外界污染、体系中重金属离子、细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。五．工艺次序的选择策略

(1)工艺流程应由不同机理的分离单元组成。(2)尽快分离、去除含量多的杂质。通常运用非特异、低分辨率的操作单元，如沉淀、超滤和吸咐等，尽快缩小样本体积，提高产物浓度。(3)尽早采用高效分离手段。(4)将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段。（一）

分离纯化的早期使用方法的选择早期分离纯化使用萃取、沉淀、吸附等一些分辨力低的方法比较有利。这些方法不仅负荷能力大，一次分离的量多，同时可以除去大部分理化性质相差较大的杂质，兼有分离提纯和浓缩的作用，可为以后的分离纯化创造良好的基础。离子交换树脂有时用于早期纯化，纤维素离子交换色谱也常直接用于粗抽提中进行多种蛋白质的制备，没有出现明显的同位效应，且具有较高的负荷能力。亲和色谱法由于具有极高的生物特异性，分离目的物受到理化性质相似的杂质干扰极少，能从比较复杂的组织抽提液或细菌发酵液中一步提取分离出所需的物质，提纯倍数可达一百倍以上。早期分离提纯的方法，选择的原则一般是从低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大为合适。但随着许多新技术的建立，一个特异性方法其分辨能力越高，便意味着提纯步骤的简化，提纯步骤的减少，回收率越高，具有生理活性物质变性的危险性就越少。

（二）各种分离纯化方法的使用程序分离方法常根据分离物质的分配系数、分子量大小、离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素构成不同分离方法的基础。而每一种分离方法又都在特定条件下发挥作用的。因此，在相同或相似的条件下连续作用同一种分离方法就不大适宜。各种分离方法的交叉使用对于除去大量理化性质相近的杂质也较为有效。某些杂质在各种条件下带电性质可能与制备相似，但在某种条件下与制备物相差较大；而另一些杂质的分子大小形状可能与制备物相似，但在某种条件下与制备物带电性质不同。在这样的情况下，先用分子筛、超速离心沉降或膜过滤方法除去分子量相差较大的杂质，然后在一定PH值和离子强度范围下使制备物变成有利的离子状态，便能有效地进行色谱分离。当然，这两种步骤的先后秩序反过来应用也会得到同样效果。纯化方法顺序先后的安排，还考虑到有利于减少工序，提高效率。如在盐析法后采取吸附法，必然因为盐离子过多影响吸附效果。中间增加透析脱盐一步，则使操作大大复杂化。如倒过来先吸附，后盐析，吸附洗脱时的含盐洗脱液即可直接进行盐析，则可达到操作简化节省原料时间的目的。此外，分离体积过大时使用盐析法和有机溶剂沉淀都能达到浓缩效果，但使用盐析法成本就低得多。某一具体产品的分离、提取工艺与下列情况有关：

1）是胞内产物还是胞外产物；2）原料中产物和主要杂质浓度；3）产物和主要杂质的物理化学特性及差异；

4）产品用途和质量标准；5）产品的市场价格；

6）废液的处理方法等。

（三）对分离纯化每一步骤方法的优劣进行综合评价

每一个分离纯化步骤方法的好坏，除了从分辨本领和重视性二方面考虑外，还注意方法本身的回收率的高低，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。

一些常用的分离纯化方法的几项特性方法

分辨本领

重现性

回收率

色谱吸附＋＋＋＋＋分配＋＋＋＋＋＋离子交换树脂＋＋＋＋＋＋＋＋分子筛＋＋＋＋＋＋＋

逆流分配＋＋＋＋＋＋电泳

自由溶液＋＋＋＋＋＋＋聚乙烯介质＋＋＋＋＋＋

纤维素＋＋＋＋＋＋＋＋

凝胶＋＋＋＋＋＋＋等电聚焦＋＋＋＋＋＋＋＋＋沉降＋膜穿透（透析）和扩散＋＋＋＋＋＋＋＋溶解度＋＋＋＋＋

长春花中Strictosidine合成酶的提纯

步骤

总蛋白比活性总活力单位产率提纯倍数

（毫克）

nKat/毫克蛋白

（nKat）

%

（Ⅰ）粗抽提液6540.0085.21001（Ⅱ）硫酸铵沉淀4660.0115.1981.3（Ⅲ）DEAE-纤维素柱38.70.103.97512.5（Ⅳ）羟基磷灰石柱590.643.87380（Ⅴ）SephadexG-750.722.82.038350(Ⅵ)等电焦点0.085.90.510737.5第一节

原材料的选择和预处理

一、原料选择

动物、植物及微生物都是制备生物大分子的材料。根据实验目的注意选择含量高，来源丰富，制备工艺简单，成本低的原材料。选择时，应注意微生物的生长期；植物的季节性；动物的生理状态。

对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高的含量。以微生物为材料时有两种情况；①利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；②利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料与其他材料的不同：

①在植物材料里，常含有大量的纤维素，很坚韧；②细胞破碎后的提纯过程中，酚类物质被氧化为暗棕色，它与其他物质混在一起很难除去；③由于植物品种和生长状况不同，其中所含的生物大分子的量变化很大；④植物材料和季节有关；⑤各器官、组织所含的成分不大相同。

对动物组织，必须选择有效成分含量丰富的脏器组织为原材料，同时必须考虑到是否便于提取，使分离精制工艺简化。动物脏器必须进行绞碎、脱脂等预处理。绞碎的目的是使有效成分能够很快被提取。固体物料用脂溶性有机溶剂脱脂，液体料液可以用油脂分离器。动物脏器可以用丙酮处理制成丙酮粉。丙酮粉含水量很低，性质稳定，可以密封保存。同时，进行了脱脂处理，对分离提纯十分有利。二、预处理动物剔除结缔组织、脂肪。植物去壳除脂。微生物分离菌体和发酵液。所用材料不能立即进行实验时，则应冷冻保存。体内易被分解的生物大分子，一般宜用新鲜材料。三、原材料的粉碎和固液的分离（一）机械法主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎。1.匀浆器2.研钵、研磨3.电磨机、球磨机、万能粉碎机和绞肉机(1)研磨珠敲打式均质器（珠磨式均质器，珠磨式匀浆机），珠子高速敲打用途：动、植物组织（含甲壳类、单细胞藻类等）及的破碎细菌、真菌类微生物、裂解，以利于DNA/RNA、蛋白质、细胞器甚至是小分子化合物的分离提取；主要品牌：法国Bertin，美国Biospec，美国MPbio，美国SPEX，瑞士Roche，德国Retsh，德国Qiagen用途：动、植物组织（含甲壳类、单细胞藻类等）及的破碎细菌、真菌类微生物、裂解，以利于DNA/RNA、蛋白质、细胞器甚至是小分子化合物的分离提取；主要品牌：法国Bertin，美国Biospec，美国MPbio，美国SPEX，瑞士Roche，德国Retsh，德国Qiagen(2)研磨式均质器（匀浆机），研磨杵、研磨管高速摩擦用途：动、植物组织及细菌、真菌等的破碎、裂解，以利于DNA/RNA、蛋白质的分离提取，小型研磨管/杵适合实验室微量生物样品，大型研磨管/杵适合工业类样品主要品牌：德国Schuett，宁波新芝，德国Retsh，日本Microtec(3)探头式均质器（匀浆机），定子、转子高速旋转形成剪切力

用途：动、植物组织以利于DNA/RNA、蛋白质的分离提取；大型设备可以用户工业样品的乳剂、霜剂制备主要品牌：美国Biospec，美国Talboys，德国IKA（广州产），瑞士Kinematica(4)超声波均质器（超声波破碎），气穴原理

用途：细菌、真菌、单细胞藻类的破碎、裂解，以利于DNA/RNA、蛋白质的分离提取。工业上用户样品的破碎、乳化、混匀等主要品牌：美国Misonix，美国Sonics，美国Branson(中国产)(5)刀片式均质器（刀片式匀浆机），刀片高速切割

用途：样品的进行细碎、匀化、分散、强烈搅拌、溶解有机物等主要品牌：美国Talboys，美国Waring，德国IKA，瑞士Consul，诸多国产品用途：样品的进行细碎、匀化、分散、强烈搅拌、溶解有机物等主要品牌：美国Talboys，美国Waring，德国IKA，瑞士Consul，诸多国产品(6)拍打式均质器（拍打式匀浆机），样品在无菌袋中被慢速敲打

用途：活细菌、寄生虫/卵的提取，及活组织细胞的分离培养。多用于食品（水果、蔬菜、肉类）的检验检疫，以及土壤、环境行业的研究。主要品牌：法国Interscience，英国Seward，天津恒奥(7)高压均质器（高压匀浆机），高压促使细胞破碎用途：细菌、真菌等的破碎、裂解。制药行业的乳剂、擦剂/霜剂、脂质制备等。中试级以上的实验室，更多的直接用于生产主要品牌：各国品牌种类繁多，不再列举（二）物理法

主要通过各种物理因素的作用使组织细胞破碎。1.反复冻融法：把待破碎样品在低温下冰冻，室温下溶解，反复操作，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.冷热交替法：操作时，将材料投入沸水中，90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。在细菌或病毒中提取蛋白和核酸时可使用此法。3.超声波处理法Ultrasonication：是利用超声波(10-15kHz)的机械振动产生空化作用(Cavitation)导致液体局部,瞬间的压力变化,从而引起液体内部发生流动,旋滑生成与消失时产生巨大的拉力,使液体拉伸,破裂并出现切变力而促进细胞破裂.此法多用于微生物材料。处理效果与样品浓度和使用频率有关。应注意溶液中气泡的存在，一些对超声波敏感的核酸及酶宜慎重使用。用超声波破碎细胞时,其蛋白质含量应低于30mg/ml.连续超声时间长,则样品温度升高.因此,通常超声30秒至1分即停止,待样品温度下降后，再次超声.每次超声时间,间隔时间及总的超声次数取决于:保持样品低温的前提下,尽可能彻底地将细胞粉碎(首次超声破碎细胞,一定要在显微镜下观察,确定超声波条件).探头的选择,取决于处理样品的量及容器大小.处理微生物细胞时，,其浓度可取50-100mg(菌体)/mL.4.加压破碎法：一般加气压或水压使每平方英寸达20.59-34.32Mpa(210-350Kg/cm2)千磅压力。此法多用于工业上微生物酶制剂的制备。(三）酶解法及化学法

1.自溶法Autolysis:

将已破碎的新鲜生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。动物材料常在0℃-4℃，微生物材料常在25℃室温条件下进行，并加入少量防腐剂。2.酶解法：Enzymaticlysis用外源溶菌酶或细胞壁分解酶（如：蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、透明质酸酶等）在一定条件下作用于细胞而使细胞壁破碎。3.表面活性剂处理法：表面活性剂分子中兼有亲脂性基团和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。在适当的温度，pH及低离子强度下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。此法对膜结合的酶的提取（如：与呼吸链有关的一些酶及乙酰胆碱脂酶）是相当有效的，但对其他蛋白质则易使其变性，甚至切断肽链。较常用的SDS十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶，去氧胆酸钠等，对细胞膜有一定破坏作用。

（四）细胞器的分离制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分为材料；或为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后，常将细胞内各组分先行分离。

细胞器的分离，一般采用差速离心，即在适当的介质中，利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。介质的选择十分重要，早期常用生理盐水，易发生聚集作用，结成块状沉淀，分离效果不理想。现在常用蔗糖、Ficoll或葡聚糖一聚乙二醇。鼠肝脏组织

↓0.25M蔗糖磷酸缓冲液肝匀浆（10%W/V）

1，000g，10/（γ平均8厘米）

沉淀

上清液

①0.25M蔗糖洗三次

②1，000g，10/（γ平均8厘米）

上清液沉淀3，300g,10/（γ平均8厘米）

（细胞核）

沉淀上清液

①0.25M蔗糖洗三次

②3，000g，10/（γ平均8厘米）

上清液沉淀（溶酶体）

100，000g,30/（γ平均6厘米）

沉淀上清液（微粒体）

各种细胞器的纯度鉴定采用形态观察法（电子显微镜）、免疫学法，标志酶活力测定法等。

肝细胞核——DNA合成酶。细胞质膜——5’—核苷酸酶，碱性对硝基苯磷酸酶，

Na+K+—ATP酶。微粒体——葡萄糖—6—磷酸酶、细胞色素C还原酶、NADPH。线粒体——琥珀酸脱氢酶，琥珀酸—细胞色素C还原酶。溶酶体——酸性磷酸酶第二节提取Extraction

提取：也称抽提、萃取，其含义基本相同，就是利用一种溶剂对物质的不同溶解度从混合物中分离出一种或几种组分的过程。一般地说，提取在分离纯化的前期进行，将经过处理或破碎的细胞置一定条件下的溶剂中让被提取的生物大分子以溶解状态释放出来。。提取方法分两类：一类为固体的处理，也称液-固萃取一类为液体的处理，也称液-液萃取

一、提取条件的选择

1.溶剂常用水、稀盐、稀碱和稀酸溶液，有的用不同比例的有机溶剂，如乙醇、丁醇、丙酮、氯仿、四氯化碳等，常用丁醇，因为其亲酯性强兼亲水性，提取效果较好。（1）可取代与蛋白质结合的脂质位置，（2）阻止脂质重新与蛋白质分子结合（3）使蛋白质在水中的溶解能力加强丁醇提取法要求的pH、温度范围较广：pH:3-6,温度：-2℃-40℃，适用于动植物和微生物原料。

2.pHpH选择很重要，与溶解度、稳定性密切相关。一般在稳定范围内选择偏离等电点两侧，如细胞色素C和溶菌酶均为碱性蛋白质，常用稀酸提取。（1）pH选3-6范围，对分离离子键有利。（2）注意测定pH的准确性，准确误差±0.1。

3.温度

一般温度在5℃以下，但对温度耐受力较高的生物大分子适当提高温度，使杂蛋白变性分离，有利于提取和下步纯化，如胃蛋白酶、酵母脱氢酶以及许多肽类激素选择37℃50℃效果比低温提取好。

总之，影响提取的因素较多，要根据经验结合具体实验条件，特别是溶剂的性质、pH、pI、介电常数、提取温度等主要因素灵活地加以运用，选择最佳条件和方法达到最佳提取效果。二、影响提取的因素

1.被提取物质溶解度的大小

一种物质在某一种溶剂中其溶解度大小和该物质的分子结构及使用溶剂的理化性质有关。一般遵守“相似相溶原理”

2.扩散作用的影响

由固体溶解于液体扩散方程式各种因素的关系可得到说明，常表示为：

c

G=DFt

xG:已扩散的物质量D：扩散系数，随温度升高而增大，随溶剂和黏度增加而降低，物质的相对分子质量越大，扩散系数越小；F：扩散面积；c：两相界面溶质浓度之差，为扩散过程的推动力，c越大，扩散越快；x:溶质扩散的距离，x越大，物质扩散到溶剂中速度越慢。t:扩散时间从上式可看出，G与c、t、F成正比，而与x成反比。D则取决于物质的种类、溶剂的温度及粘度，物质扩散速率随温度升高而升高（对生化药物温度升高是有限度的）。减少溶剂的粘度，搅拌以保持两相界面之最大浓度差，提高细胞破碎程度以增大扩散面积，减少扩散距离，延长提取时间及采用分次提取等方法，都可以大大提高物质扩散速度，增加提取效果。3.分配作用的影响

被提取的物质，在二个互不相溶的液相中，分配定律起着主要作用。分配定律表示为在恒温、恒压和比较稀的浓度下，某一溶质在二个不相混合的液相的浓度分配比是个常数。

c1恒温恒压下=K

c2c1:表示分配达到平衡后溶质在上层有机相中的浓度

c2：表示分配达到平衡后溶质在下层水相中的浓度

K：为分配常数，不同溶质在不同溶剂中有不同的值。K值越大，则在上层有机相中溶解度越大；反之，K越小，在下层水相中溶解度越大。当混合物中各组分K值彼此接近时，只有不断更新溶剂，多次抽提才能彼此分开。三、超临界气体萃取技术以气体为萃取剂，当气体处于超临界温度和临界压力时，呈现一种既非液相又非气相的流体，兼有液体和气体的特性，如密度接近液体，粘度接近气体，具有良好的溶剂性质。气体萃取必须具备：1.临界压力低；2.临界温度接近于室温；3.化学稳定性好；4.价廉易得。主要有二氧化碳、氮气、乙烯等，二氧化碳最常用。

本技术应用于酶、不饱和脂肪酸的提取、精制和回收，与减压干燥法比较，耗能少，且缩短脱溶的时间。1．超临界流体萃取的简介

超临界流体萃取(Supercriticalfluidextraction，简称SFE)是用超临界条件下的流体作为萃取剂，由液体或固体中萃取出所需成分(或有害成分)的一种分离方法。超临界流体(Supercriticalfluid，简称SCF)是指操作温度超过临界温度和压力超过监界压力状态的流体。

在超临界状态下的流体，具有接近于液体的密度和类似于液体的溶解能力，同时还具有类似于气体的高扩散性、低粘度、低表面张力等特性。因此SCF具有良好的溶剂特性，很多固体或液体物质都能被其溶解。常用的SCF有二氧化碳、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷和氨等．其中以二氧化碳最为常用。由于SCF在溶解能力、传递能力和溶剂回收等方面具有特殊的优点．而且所用溶剂多为无毒气体．避免了常用有机溶剂的污染问题。

早在100多年前，人们就观察到临界流体的特殊溶解性能，但在相当长时间内局限于实验室研究及石油化工方面的小型应用。直到20世纪70年代以后才真正进入发展高潮。1978年召开了首届专题讨论会，1979年首台工业装置投入运行，标志着超临界萃取技术开始进入工业应用。超临界萃取之所以受到青睐，是由于它与传统额液-液萃取或浸取相比，有以下优点：①萃取率高；②产品质量高；③萃取剂易于回收；④选择性好。

2．超临界萃取的基本原理2．1．超临界流体特性所谓超临界流体（SCF），是指一类压强高于临界压强Pc,温度高于临界温度Tc，的流体，这种流体既不是液体，也不是气体，是一类特殊的流体。ρ(Kg·m-3)D(m2·s-1)μ(Pa·S)气体（0.1Mpa,15～30℃）0.6～2(0.1～0.4)×10-4(0.1～0.3)×10-4液体（0.1Mpa,15～30℃）600～1600(0.02～0.2)×10-8(0.02～0.3)×10-2超临界流体，P=Pc，T=Tc200～5007×10-8(0.1～0.3)×10-4P=4Pc，T=Tc400～9002×10-8(0.3～0.9)×10-4表1超临界流体的物性及与普通流体物性的比较表1将超临界流体的这些物性与气体、液体的相应值作了比较。从表中可以看出：

①超临界流体的密度接近于液体密度，而比气体密度高得多。另一方面．超临界流体是可压缩的，但其压缩性比气体小得多；②超临界流体的扩散系数与气体的扩散系数相比要小得多，但比液体的扩散系数又高得多；③超临界流体的粘度接近于气体的粘度，而比液体粘度低得多。2.2．超临界萃取原理超临界流体萃取分离过程是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。当气体处于超临界状态时，成为性质介于液体和气体之间的单一相态，具有和液体相近的密度，粘度虽高于气体但明显低于液体，扩散系数为液体的10～100倍；因此对物料有较好的渗透性和较强的溶解能力，能够将物料中某些成分提取出来。2．3．萃取溶剂的选择并非所有溶剂都适宜用作超临界萃取，超临界萃取对溶剂有以下要求:①有较高的溶解能力．且有一定的亲水—亲油平衡；②能容易地与溶质分离，无残留，不影响溶质品质；③无毒，化学上为惰性，且稳定；④来源丰富，价格便宜；⑤纯度高。在所研究的超临界物质中，只有几种适用于超临界萃取的溶剂：二氧化碳、乙烷、乙烯，以及一些含氟的氢化合物，其中最理想的溶剂是二氧化碳，它几乎满足上述所有要求，它的临界压强为7.38MPa，临界温度为31.16℃，目前几乎所有的超临界萃取操作均以二氧化碳为溶剂。

其的主要特点是：①易挥发，易于与溶质分离；②粘度小，扩散系数高，有很高的传质速率；③只有分子量低于500的低分于化合物才易溶于二氧化碳；④中、低分子量的卤化物、醛、酮、酯、醇、醚易溶于二氧化碳；⑤极性有机物中只有低分子者才溶于二氧化碳；⑥脂肪酸和甘油三酯不易溶于二氧化碳，但单酯化作用可增加溶解度；⑦同系物中溶解度随分子量的增加而降低；⑧生物碱、类胡萝卜素、氨基酸、水果酸、氯仿和大多数无机盐不溶于二氧化碳3．超临界流体萃取的特点

1．萃取和分离合二为一

当饱含溶解物的二氧化碳超临界流体流经分离器时，由于压力下降使得CO2与萃取物迅速成为两相(气液分离)而立即分开，不存在物料的相变过程，不需回收溶剂，操作方便；不仅萃取效率高，而且能耗较少，节约成本。2．压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数

临界点附近，温度压力的微小变化．都会引起CO2密度显著变化，从而引起待萃物的溶解度发生变化。可通过控制温度或压力的方法达到萃取目的。压力固定，改变温度可将物质分离；反之温度固定，降低压力使萃取物分离；因此工艺流程短、耗时少。对环境无污染，萃取流体可循环使用，真正实现生产过程绿色化3．萃取温度低CO2的临界温度为31.16℃。临界压力为7.38MPa，可以有效地防止热敏性成分的氧化和逸散，完整保留生物活性，而且能把高沸点、低挥发度、易热解的物质在其沸点温度以下萃取出来。4．无毒、无污染

临界CO2流体常态下是气体，无毒，与萃取成分分离后，完全没有溶剂的残留，有效地避免了传统提取条件下溶剂毒性的残留。同时也防止了提取过程对人体的毒害和对环境的污染。5．超临界流体的极性可以改变

一定温度条件下，只要改变压力或加入适宜的夹带刑，即可提取不同极性的物质，可选择范围广。5．超临界萃取技术的应用在食品工业中用于茶叶、咖啡豆脱咖啡因；食品脱脂；酒花有效成分提取；植物色素的萃取；植物及动物油脂的萃取。在医药工业中用于酶、维生素等的精制；动植物体内药物成分的萃取；医药品原料的浓缩、精制；糖类与蛋白质的分离以及脱溶剂脂肪类混合物的分离精制等。在化妆品工业中用于天然香料的萃取；合成香料的分离精制；化妆品原料的萃取、精制。超临界萃取流程6．应用前景

我国资源丰富，用超临界萃取有广泛的应用前景。许多都可以用超临界流体技术进行加工，如：银杏叶、鱼油、卵磷脂、沙棘油、川芎等。大力开展这方面的研究，能获得很高的经济效益。超临界萃取技术的应用，除对环境污染少、操作简便、温度低、省时、提高收率外，还能得到许多种常规法得不到的成分，这也为我国中药材化学成分的提取和分离提供了一种有效方法。相信随着人们对环境保护的日益重视和绿色时代的要求，超临界流体技术将促进其进一步的开发和利用第三节分离纯化生物大分子的特点是成分复杂，含有各种同类或异性物质，必须进行纯化，才能获得精制的纯品。主要应用的方法有

盐析法、有机溶剂沉淀法、pI沉淀法、膜分离法、层析法、凝胶过滤法、离子交换法等。一、盐析法Saltingout利用不同的蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度不同程度的降低来进行分离纯化。

原理：蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团的静电引力造成的，由于水中加入少量盐，增加了溶液的极性，减弱了蛋白质分子间的作用力，促使其溶解度增大，盐浓度增加到一定程度时，水的活度被降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子相互聚集而沉淀析出。盐析机理示意图盐析的机理①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。

SLog━━=—KsI

①

S0S0——蛋白质在纯水（离子强度I=0）中的溶解度。S——蛋白质在溶液的离子强度为I时的溶解度。Ks——盐析常数。

1I=━━εmiZi

2

②2mi——溶液中各种离子克分子浓度（物质量浓度）

Zi——各种离子的价数①式中当T为一定时，So对于某一蛋白质在某一溶液中的溶解度为一常数，故①式可改写为LogS=β—Ks×I

③

式②中β=LogSo也为一常数，β值主要取决于蛋白质的性质，溶液的pH和温度。

Ks值主要和盐的性质（包括盐离子价数和平均半径）有关，也和蛋白结构有关。一般来说蛋白在某一盐溶液中Ks越大，盐析效果越好，根据③式分离纯化蛋白质和酶，可以在一定的pH及温度下改变盐的I值，称为“Ks分段盐析法”，提纯前期常应用此法。在一定I值时，改变pH及温度称为“β分段盐析法”，常用于提纯后期，特别是使某些蛋白质结晶析出时。

S2—S1V=Vo━━━━1—S2

V：所需饱和度硫酸铵溶液体积Vo：原溶液体积S2：所需达到的饱和度S1：原溶液的饱和度

若蛋白质溶液中已有一定饱和度的盐，为了分段盐析，需要增高饱和度时，应用下列公式计算：

所需达到饱和度较高，而液体的体积又不能过分增大，可直接加入固体硫酸铵，其加入量可按下式计算：

G（S2—S1）X=━━━━━1—AS2X是将一升饱和度为S1溶液提高到饱和度为S2时所需的硫酸铵的重量，G及A为常数，与温度有关。

G在0℃为707A0℃为0.2720℃为75620℃为0.29盐析时注意以下问题1.盐饱和度的影响由于蛋白质的结构和性质的不同，盐析要求的饱和度也不同，只有正确计算饱和度，才能达到盐析的目的。2.pH值选择蛋白质在等电点时溶解度最小，最易从溶液中析出沉淀，要选择在蛋白质的等电点附近。3.蛋白质浓度的影响

在相同的盐析条件下蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度极限也愈低。4.温度

一般可在室温下进行，某些蛋白质对温度敏感，如尿激酶最好在低温下进行。5.脱盐

蛋白质、酶用盐析法沉淀分离后常需脱盐才能获得纯品，脱盐常用的方法是透析法。二、有机溶剂沉淀方法在同一或相邻蛋白质分子中相互作用的力由于水的介电常数很高（在200C、为79）而降低，同时蛋白质分子的极性基因与水分子却发生了相互作用，因而有利于蛋白质的溶解。乙醇和丙酮沉淀能力强，是最好的常用的有机溶剂。有机溶剂沉淀法比盐析法分辨力强，易干燥，沉淀好过滤，但易引起失活，注意防止溶剂挥发和火灾1.控制工艺过程的温度2.防止溶剂局部浓度过高3.及时处理沉淀物4.pH的选择5.比盐析法条件严格

有机溶剂沉淀原理图三、等电点沉淀法

利用蛋白质在pI时溶解度最低，而各种蛋白具有不同pI的特点进行分离的方法。1.单独使用效果不理想。2.分辨率也差。3.多用于提取后去除杂蛋白。

四、膜分离法膜分离技术包括超滤、反渗透析、电渗析、微孔过滤和精密过滤，在医药领域较为常用。

1.超滤法Ultrafiltration

根据溶质分子和悬浮粒子是否通过多孔膜来进行筛分，在液压驱动下能通过超滤膜的分离粒子的范围，一般为0.001-0.01um，就是说，使用一种特制的薄膜可对溶液中各种溶质分子进行选择和滤过。也可在一定的压力下（外源氮气压或真空泵压），使溶剂和小分子滤过超滤膜，而大分子物质受阻保留在原液中。流路膜表面普通过滤切向流速透过流速溶液浓度Cb膜表面超滤膜表面浓度Cw不溶有机物滤布和深层过滤器筛网和滤网微滤超滤纳滤反渗透过滤工艺范围红细胞乳胶油乳剂油漆颜料细菌沙粒人发蛋白/酶碳粒病毒辐射原子可溶盐类VOC抯,PCD,Susp.Oil金属离子膜类型普通污染物的相对尺寸过滤/分离范围颗粒尺寸10-410-310-210-11.010102103(微米)平均分子量10020020,000500,000

优点：1.操作方便条件温和，与蒸发冻干等比较，没有物相的变化，对不稳定酶的浓缩尤其适用。2.成本低，回收率高。3.在浓缩的同时还可除去一些低分子量的物质。缺点：

1.不能直接得到干粉制剂。

2.对于蛋白质溶液一般只能得到10—50%的浓度，应用超滤法时关键在于膜的选择。压力流道进口出口体积超滤实验室系统压力进口出口体积进口，浓缩透出流道

循环透出制备规模的超滤系统超滤膜组件透出流进料循环流膜进口压力回流压力透出压力进料流道(涂膜的或开放式的)透出流道超滤的基本操作冲洗完整性测试缓冲液条件工艺

–浓缩工艺

–透析产品的回收CIP(SIP)水通量测试保存透析缓冲液初始进液循环透出进液罐泵膜冲洗2.反渗透

以高分子透过性的薄膜为分离介质，在超过溶液渗透压力的情况下使溶液中的溶剂透过薄膜，用于生产注射用水，氨基酸、激素的浓缩，如美国的Millpore公司专门设计反渗透装置。此法与蒸馏、电渗比较具有能量消耗少、体积小等优点。3.微孔滤膜法高分子材料制成的薄膜的微孔0.2-10um之间，广泛应用于滤除微粒和微生物、热敏性药物的除菌，如胰岛素、ConA、ATP、血清蛋白、丙种球蛋白、激素等。4.超精密过滤以聚丙烯醇为主体的中空多孔滤膜，分级性能在超滤膜与微孔滤膜之间，为0.01-0.2um，用于水的精制（脱除铁质、菌和微粒）。五、层析

1.离子交换层析：20世纪40年代发展起来的采用不溶性的高分子化合物作为离子交换剂，分离各种生物物质。2.凝胶层析：整个过程和过滤相似，又称凝胶过滤、分子筛过滤，设备简单，操作方便，回收率高，应用于氨基酸、多肽、蛋白质和酶等分离和提纯。3.亲和层析:生物活性物质都有亲和作用如酶与底物、激素与受体、核酸与互补链间，它的设计是利用生物大分子特异亲和力而设计的一种层析技术，配基是可以可逆结合的特异性物质。

通过一次性处理，可获得高纯度的活性物质可分离材料中极微的物质，设备要求不高，操作简单，适用范围广，特异性强，分离速度快，效果好，条件温和等优点。第四节浓缩浓缩是低浓度溶液通过除去溶剂（包括水），变成高浓度溶液的过程，常在提取后和结晶前进行，有时贯穿在整个生化制药过程。沉淀（包括盐析和有机溶剂沉淀）广义上说也是一种浓缩方法。

一、蒸发法

蒸发是溶液表面的溶剂分子获得的动能超过了溶液内溶剂分子间的吸引力，脱离液面逸向空间的过程。

任何温度下都在蒸发，蒸发的快慢首先与温度有关。其次，与蒸发面积有关，表面积越大，单位时间内气化的分子越多，蒸发越快。还和液面蒸汽分子密度，即蒸气压大小相关。各种液体在一定温度下都具有一定饱和蒸气压，当液面上的溶剂蒸气分子密度很小，经常处于不饱和的低压状态，液相与气相的溶剂分子为了维持其分子密度的动态平衡状态，溶液中的溶剂分子就必须不断地气化，逸出空间，以维持其一定的饱和蒸气压力。因此，根据上述原理，蒸发浓缩装置常应加热，扩大液体表面积，低压和加速空气流动等因素设计。二、薄膜蒸发浓缩

直接用蒸气加热的薄膜浓缩器液体温度可达60—80℃，适于一些耐热的酶、蛋白质和小分子生化产品的制备。对温度敏感及易受薄膜切力影响而变性的核酸大分子及其他生物大分子则不易使用，某些粘度很大容易结晶析出的物质也不宜使用此法。三、减压加温蒸发浓缩

通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快。此法适用于一些不耐热的生物大分子及生化制品的浓缩。转动减压蒸发器：适用于浓缩少量，不耐热、粘度较大的物质。四、空气流动蒸发浓缩空气流动可以使液体加速蒸发。将铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流，或将生物大分子溶液装入透析袋置于冷室内，通过流动的空气使透过膜外的溶剂不断蒸发，而达到浓缩的目的。五、冰冻法生物大分子在冰冻时，水分子结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中。操作时，先将待浓缩的溶液冷却使之成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融解点的差别而达到除去大部分溶剂的目的，蛋白质的盐溶液，纯冰结晶浮在液面，蛋白质集中于下层溶液中。第五节蛋白质和酶的结晶

概念：使溶质呈晶态从溶液中析出的过程。对蛋白质来讲，结晶（1）可作为一种纯化方法；（2）可作为一个均一性证据；（3）作为一个稳定的保存方法；（4）长成单晶后，可提供做X射线衍射分析。

原理在合适的过饱和状态下，溶质分子通过扩散、旋转、碰撞等运动方式，形成晶核，结晶时，溶质分子通过适当途径在恰好成90°角时以相对碰撞作用方式有序而反复地堆砌到晶核上，于是晶核上长大晶体形成，晶体从溶液中析出。

生物大分子一般都是由许多相同或相似的单体微粒聚合而成的，故不少生物大分子，也具有形成晶体的能力，但不是所有生物大分子都能在溶液中形成晶体，只有大多数球蛋白、酶容易在溶液中结晶析出。生物大分子晶体由于WM大，结构形状比较复杂，与一般无机化合物和金属所形成的晶体比较，有些性质上的差别。

二、蛋白质和酶结晶条件大多数为针状、棒状、片状、八面体或立方体的菱状结晶。1.纯度：一般来说不应低于50%，总的趋势是制品越纯越易结晶。大多数生物大分子第一次得到结晶后仍可以进行多次的重结晶，每次重结晶纯度均有一定提高，直到衡定为止。2.浓度：过饱和程度高，结晶容易形成，但过饱和浓度很高时，析出的结晶多数是微小晶体。欲获较大晶体时，需经适当稀释。通常球蛋白的浓度采用10—50