家畜育种学课件第十二章

家畜育种学课件第十二章第一页，共六十一页，2022年，8月28日第一节生物技术的基本概况一、生物技术的产生与发展

生物技术是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物作反应器将物料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。第二页，共六十一页，2022年，8月28日年代事件1917KarlEreky首次使用“生物技术”这一名词1943大规模工业生产青霉素1944Avery,Macleod和McCarty通过实验证明DNA是遗传物质1953Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构1961~1966遗传密码破译1970分离出第一个限制性内切酶1973Boyer和Cohen建立了DNA重组技术1976第一个DNA重组技术规则问世1976DNA测序技术诞生1978Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1980第一台商业化生产DNA自动测序仪诞生1982第一个转基因动物诞生1983基因工程Ti质粒用于植物转化1988PCR方法问世1985~1990许多分子生物技术出现1997英国培育出第一个克隆羊多莉1998日本培育出克隆牛，英美等国培育出克隆鼠二、动物育种技术及其发展现代生物技术发展史上一些重要事件年表

第三页，共六十一页，2022年，8月28日ed三、动物育种中的现代生物技术第四页，共六十一页，2022年，8月28日第五页，共六十一页，2022年，8月28日第六页，共六十一页，2022年，8月28日2006年1月11日，美国科学家宣布培育出了世界上首只转基因猴“安迪”，为人类最终战胜糖尿病、乳腺病、帕金森氏症和艾滋病等顽症提供帮助。I’mAndy.第七页，共六十一页，2022年，8月28日转基因斑马鱼，会在特别的光照下发出不同的光芒

第八页，共六十一页，2022年，8月28日胚胎移植第九页，共六十一页，2022年，8月28日第二节转基因动物技术

一、转基因动物的概念

转基因动物技术是将外源DNA导入性细胞或胚胎细胞并生产出带有外源DNA片段动物的一种技术。第十页，共六十一页，2022年，8月28日二、转基因动物技术的一般步骤

生产转基因动物的步骤包括：

(1)选择能有效表达的蛋白质；

(2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因；

(3)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基因调节序列；

(4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细胞或小鼠中预先检验其表达情况；

(5)把拼接的基因引入到受精卵的细胞核中；

(6)把引入后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发育；

(7)检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达情况以及外源基因在其后代中的传递情况。部分后代细胞携带有转入的外源基因，利用这些动物培育新的品系。第十一页，共六十一页，2022年，8月28日第十二页，共六十一页，2022年，8月28日三、导入基因的方法

(一)显微注射法

(二)精子载体法

(三)胚胎干细胞(ES)介导法

(四)染色体片段显微注入法第十三页，共六十一页，2022年，8月28日第十四页，共六十一页，2022年，8月28日

(一)

显

微

注

射

法

第十五页，共六十一页，2022年，8月28日人们已利用显微注射法将胸苷激酶基因、生长激素基因和鼠myc基因转入了哺乳动物细胞。这种方法不仅可以获得转基因动物所用的转基因动物细胞，而且也可以通过哺乳动物细胞来生产有用的蛋白质。(目前认为胃癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、何杰金氏病及头部肿瘤等都有myc基因的扩增或过度表达)

小鼠和兔的受精卵原核在普通显微镜下容易看到，而绵羊，尤其是猪和牛的卵细胞质稠密，不能看到原核。Hammer等用干涉相差显微镜可观察到80％的绵羊卵核，而猪和牛的卵子需经离心处理再用干涉相差显微镜才能观察到卵原核，离心处理后的多数受精卵仍能正常发育。第十六页，共六十一页，2022年，8月28日第十七页，共六十一页，2022年，8月28日(二)精子载体法方法：将成熟的精子与带有外源DNA的载体进行共培育之后,使精子有能力携带外源DNA进入卵中，使之受精，并使外源DNA整合于染色体中。Bracet等(1971)将家兔精液和放射性标记的SV40病毒DNA孵育后，在精子头部能够检测到放射活性，病毒DNA在受精过程中被带入了卵细胞。Lavitravo等(1989)把质粒与小鼠的附睾精子共孵育30min，进行体外授精和移植，结果获得250个后代中，30％的为阳性，部分小鼠表达了CAT基因并传到F1代。这一方法在转基因鼠上的应用使人们看到转基因动物效率提高的希望。影响DNA与精子结合的因素可能是获得成功的关键性因素，首先哺乳动物精子吸附外源DNA需特定的时期；其次精子吸附DNA时精子活性及DNA性质都受影响。利用精子作为基因转移的工具，在实践中存在许多问题，但此技术至少在构思上对于大动物转基因研究具重要意义。第十八页，共六十一页，2022年，8月28日(三)ES细胞介导的转基因动物生产胚胎干细胞(embryonicstemcell)是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团的细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞注入寄主胚泡后，参与胚胎形成，进入嵌合体动物的生殖系统。用DNA转染法或反转录病毒介导法可将基因导入胚胎干细胞，选出带有目的基因的细胞克隆，然后导入受体胚胎。由此法生成的后代都是嵌合体，若由这些嵌合体胚胎中再分离出干细胞，用核移植技术将其细胞核植入无核卵细胞，这样可以提高转基因的效率。生物学中嵌合体是指同一个体中不同基因型的组织相互接触而存在的现象。第十九页，共六十一页，2022年，8月28日以噬菌体或病毒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程第二十页，共六十一页，2022年，8月28日

2007年3月24日英国《每日邮报》报道说，美国内华达大学教授伊斯梅尔·赞贾尼历经７年研究，最终利用向绵羊胚胎注射人体干细胞的技术，成功培育出一只含有１５％人体细胞的绵羊。科研人员首先从人体骨髓中提取干细胞，然后将干细胞注入胎羊的腹膜中，这样人体细胞就会通过新陈代谢和循环系统进入胎羊体内各个器官。羊羔降世两个月后，就会长出含有人体细胞的肝、心脏、肺等器官。第二十一页，共六十一页，2022年，8月28日（四）染色体片段显微注入法染色体介导法是指从人或动物染色体上割取特定的染色体片段(M期)或分离出来之后，以其为媒介将外源基因注入动物早期胚胎中，以获得外源DNA的动物，严格地讲称为转染色体动物。通常人们采用离心分离法或流式细胞仪(fowcytometry)分离法分离染色体。尽管目前该技术应用困难较大，且成功率很低(0～0.002％)，但由于它具有不需经基因重组就可转移超大型外源DNA(大于1000kb)之独特优点，适于多基因转移。鉴于本法导入的遗传信息片段长，能生产出具备某些特殊疾病的实验动物模型。第二十二页，共六十一页，2022年，8月28日四、基因的选择与转基因动物的研究现状1.转入基因的选择目前在动物转基因的选择上主要包括四大类：

(1)与机体代谢调节有关的蛋白基因，这类基因参与机体组织生长发育的调节，如生长激素基因等；

(2)抗性基因；抗逆、抗病等；

(3)经济性状的主效基因，如猪和绵羊的高繁殖力基因、肉牛的“双肌”基因等，这些基因与动物的生产力密切相关；

(4)治疗人类疾病所需的蛋白质基因，以拓宽动物的经济用途。第二十三页，共六十一页，2022年，8月28日提高动物生长、生产性能的研究

美国伊利诺斯大学研究出一种带牛生长激素的转基因猪，这种猪生长快,体大,饲料利用率高，可给养猪业带来丰厚的经济效益。Bawden的研究小组1995年报道了成功地在转基因小鼠和绵羊中表达了细胞半胱氨酸生物合成基因，以此尝试改良羊毛的生长。半胱氨酸是羊毛合成的限制性氨基酸。1995年，BullockD.W.生产的转类胰岛素IGF－I的基因羊的羊毛产量得到了提高。1996年,新西兰科学家Damak等将小鼠超高硫角蛋白启动子与绵羊的IGF－IC13AJA融合基因显微注入绵羊原核期胚胎，培育出的转基因羊，其净毛平均产量比非转基因羊提高了6.2%。

2.转基因动物的研究现状第二十四页，共六十一页，2022年，8月28日(2)改变奶蛋白成分和性质的设想在奶牛和奶羊上，转基因的主要途径是改变乳的成分、提高产乳量和生长速度。例如转入一个超量表达的K酪蛋白基因能够增加酪蛋白的产量。通过胚胎基因转移技术导入原有基因的额外拷贝、采用某些奶蛋白高水平表达基因的调节序列以及转移另一物种的奶蛋白基因或修饰基因，可以改变原有奶蛋白的成分和性质，如把人奶蛋白产物引入家畜奶中，以这种家畜的奶替代人奶，或增加牛奶中某些蛋白质的浓度，改变牛奶加工处理的性能等，目前分离出改变奶成份的有关基因。(3)利用家畜生产药物蛋白的研究htPA(人组织型纤溶酶原激活剂)第二十五页，共六十一页，2022年，8月28日五、转基因动物的应用前景应该看到，今天人类在转基因动物方面所取得的成果还仅仅处在起步阶段。随着生命科学各个领域的不断发展，新的突破会不断产生，一些在实验室中获得的结果可以不断地运用到生产实践中去。例如，澳大利亚、新西兰、南非、英国等主要产羊毛国家目前正在致力于开发一种可以生产彩色羊毛的高产的转基因羊。类似的设想还很多，相信在未来，人们可以创造出更多有良好经济效益的物种，使地球的生物圈变得更加丰富多彩。转基因技术的诞生、成熟和推广正在给养殖业带来一场新的革命。第二十六页，共六十一页，2022年，8月28日转基因存在的问题1.成本高，但是成功率低按供体进行超排，获取受精卵计算生产一头转基因猪$2.5万,生产一头转基因牛$50万。2.转基因整合和表达效率低3.转基因的遗传率低转基因动物及其后代并不能够保证外源基因世代传递，外源基因很容易从基因组中丢失。第二十七页，共六十一页，2022年，8月28日ATA(G0)×ATA(G0)ATA(G0)×AA(非转基因动物)↓↓ATAT:2ATA:AA=1:2:1ATA:AA=1:1理论上：转基因动物为75%50%实际上:30%15.2%

通过检验，差异极显著。第二十八页，共六十一页，2022年，8月28日4.存在与预期结果不相符的现象原因：(1)物种间的差异同一种疾病在不同的物种发病机制可能不同。(2)物种体内有复杂的调控和平衡机制，单一外源基因对动物整体的作用可能有限。(3)转基因的整合、表达和调控不能达到真正人为控制。5.转基因产品制备导致了一些社会问题主要是产品的安全问题。第二十九页，共六十一页，2022年，8月28日第三节动物克隆技术一、动物克隆的概念

所谓克隆(cloning)就是无性繁殖，动物克隆(animalcloning)就是不经过受精过程而获得动物新个体的方法。克隆动物(cloninganimal)就是指不经过生殖细胞而直接由体细胞获得新的动物个体。第三十页，共六十一页，2022年，8月28日

然而研究人员对克隆的具体定义仍存争议，有些人认为凡是不经过受精过程而获得新个体的方法叫克隆；而另一些人则认为只有像在植物中那样，从一个具有全能性的体细胞直接再生出新个体才能叫克隆。但在目前的技术水平条件下，所有的高等动物体细胞都必须将其遗传物质转入卵细胞或原核胚后才能再生，也就是说，必须借助于卵细胞或原核胚的细胞质中的某些特殊物质才能进行正常的生长发育，而不能从体细胞直接再生获得新的个体。因此，按照后一种说法现在的所谓“克隆”动物其实都不是真正意义上的克隆。然而，目前人们所接受的克隆动物实际上是前一种比较宽松的克隆定义。第三十一页，共六十一页，2022年，8月28日

克隆动物技术实际上是结合采用了核移植与胚胎生物工程技术。其操作步骤大体为：1）体细胞的采集和培养；使已失去全能性的体细胞恢复全能性；2)采集卵细胞并去除卵细胞的细胞核；3）取出体细胞的细胞核；4)用微注射法注入去除核的卵细胞中去；5)将重组胚细胞在体外进行适当培养；6）将转核胚置入同期母体子宫，完成发育，所产生的动物幼子为克隆动物。二、克隆动物的一般步骤第三十二页，共六十一页，2022年，8月28日克隆动物操作的一般步骤第三十三页，共六十一页，2022年，8月28日三、影响动物克隆的因素细胞融合的条件细胞发育阶段可对核移植实验产生影响

细胞诱导分裂成熟因子(MPF)的活性

卵细胞中的大分子物质的影响第三十四页，共六十一页，2022年，8月28日四、克隆动物的意义与前景1.可以用于动物资源的种质保存，可尽可能多地保存地球生物圈内的多样性。2.可以生产移植器官、利用动物作生物反应器生产药物和提供实验动物，造福人类。还可以通过克隆哺乳动物某些特定发育阶段的胎儿，对人类的某些顽症实施“细胞治疗”。3．可以克隆家畜和濒临灭绝的动物，如大熊猫等。4.利用哺乳动物体细胞克隆技术，可通过建立转基因体细胞系的方式，克隆转基因动物。体细胞克隆技术生产转基因动物，体细胞克隆中所生后代全都携带外源基因，可望降低生产成本。5.体细胞克隆技术可以直接把优良物种特性传递下去,培育优良物种,有助于缩短育种年限,加速动物育种进程,提高育种效率。第三十五页，共六十一页，2022年，8月28日第四节胚胎生物工程技术

胚胎生物工程技术包括鲜胚和冻胚移植、胚胎分割、胚胎冷冻、冷胚切割、体外受精、胚胎干细胞培养、分离与克隆等技术，在国外已进入实用性阶段。MOET育种技术就是在此基础上而产生的一种新的家畜育种技术，即主要是利用超数排卵、人工授精、胚胎移植等生物工程技术来加快遗传进展和良种培育速度。胚胎干细胞培养、分离与克隆技术的成功在胚胎工程中具有重要意义，它能够有效解决胚胎细胞的来源。第三十六页，共六十一页，2022年，8月28日一、冷冻精液与人工授精技术

人工授精是利用器械采集公畜的精液，经检查和处理后，再用器械将精液输入到发情母畜的生殖道内,以代替公、母畜自然交配而繁殖后代的一种技术。在动物育种中可以提高优良种公畜的配种效能和种用价值，扩大配种母畜的头数；加速家畜品种改良，促进育种工作进程。冷冻精液不但能够提高优秀种公畜的利用率，促进品种改良，提高生产性能，而且使用冷冻精液不受地域、时间的限制，所以冷冻精液已成为目前动物遗传资源保护、保存的重要方法之一。第三十七页，共六十一页，2022年，8月28日二、同期发情与超数排卵技术

同期发情技术主要是借助外源激素刺激卵巢，使其按照预定的要求发生变化，使所处理母畜卵巢生理机能都处于相同阶段，从而使母畜在短时间内统一发情，并能排出正常的卵母细胞，以便达到统一配种、受精、妊娠的目的。超数排卵是应用外源性促性腺激素诱发卵巢多个卵泡发育，并一次排出具有受精能力的多个卵子的方法。对优秀的母畜进行超排处理，然后进行授精，一次就可得到多个优秀种畜的胚胎。

超数排卵是基础，胚胎移植是手段。第三十八页，共六十一页，2022年，8月28日三、胚胎冷冻保存与切割技术

胚胎冷冻保存一般是指在干冰（-79℃）和液氮（-196℃）中保存胚胎。其最大优点是胚胎可以长期保存，而对其活力无影响。动物胚胎冷冻技术自建立以来，已进行了改进，方法趋于简单实用。这种方法也是动物遗传资源保护的重要方法之一。四、胚胎移植技术

胚胎移植是将鲜胚或冷冻胚解冻后人为地注入受体动物的子宫角内，以完成胚胎发育。由于动物的大小不同，分手术法和非手术法两种。第三十九页，共六十一页，2022年，8月28日五、胚胎干细胞技术

胚胎干细胞（ES）是胚胎发育早期还没有分化的细胞，它具有向不同细胞分化的全能性。胚胎干细胞技术是近年来发展起来的一项具有发展潜力的技术。胚胎干细胞的培养、分离与克隆，进而建立不同动物的胚胎干细胞系已成为胚胎生物工程技术领域的研究热点。胚胎干细胞作为一种新型的实验材料，广泛应用于动物克隆、转基因动物的生产、真核细胞基因的表达与调控、人类遗传病动物模型的创建，人类器官移植材料的生产以及细胞分化机制的研究等领域。胚胎干细胞分离与克隆技术、基因工程和胚胎工程相结合，对于阐明动物生长发育的基本规律、抢救和保护濒危动物遗传资源、建立先进的动物育种技术体系具有重大的理论意义和实践价值。第四十页，共六十一页，2022年，8月28日六、MOET育种技术

MOET育种技术是动物胚胎生物工程技术在动物育种中的综合运用。它是采用同期发情、超数排卵和胚胎移植等配套技术进行优质动物个体快速扩繁的一种方法。具体操作是对优秀的母畜(供体)进行超数排卵处理后，用特别优秀的公畜交配，然后冲出胚胎，移植到同期发情的一般个体(受体)的子宫中完成胚胎发育过程，使一头优秀母畜一年可产众多的优秀后代。MOET育种技术目前已用于优秀奶牛、肉牛、肉羊的快速扩繁和育种。

第四十一页，共六十一页，2022年，8月28日人工授精站育成母牛核心群供体牛胚胎核心公牛青年公牛ET-犊牛♀♂青年牛性能测定站（生长发育性状）♀♂ET生产群核心群生产群MO一定数量的优秀母牛青年公牛：利用全-半同胞信息进行育种值估计后，选择一定数量的核心公牛为核心群青年公牛的遗传评定提供半同胞信息600-1000头MOET核心群育种体系的基本流程示意图第四十二页，共六十一页，2022年，8月28日七、性别控制与胚胎性别鉴定1.性别控制对于具有限性性状的畜种的生产具有重要的意义如奶牛、蛋鸡、驯鹿等，SRY（Sex-determiningRegionofYgene），最初该基因是在性反转人上发现的，它是Y染色体上的性别决定序列，是主宰性别睾丸决定因子的遗传基础，准确率95-100%.TDF(TestisDeterminingFactor)。2.对于广泛应用人工受精技术的畜种，公畜的需要量有限，可以通过性别控制增加母畜头数，从而提高母畜的选择强度，加快母畜的遗传进展。在家畜育种中的意义第四十三页，共六十一页，2022年，8月28日3.在一个杂交育种方案中，可以根据需要在育种方案的不同阶段，灵活的应用性别控制技术。如:在肉牛杂交育种的开始阶段，通常需要更多的杂种母牛；在横交固定阶段，则需要选育一定数量的公牛；在肉牛生产群中除了需要一定数量的母牛外，需要更多的公牛育肥。4.在实际中，牛如果一胎生两个异性牛的话，通常会导致异性双胞胎的不育现象。经过性别鉴定的胚胎移植，可以广泛的实施一头受体母牛移植两枚胚胎，从而提高繁殖率。5.胚胎克隆技术实施前，首先需要进行性别鉴定。七、性别控制与胚胎性别鉴定第四十四页，共六十一页，2022年，8月28日第五节分子生物技术与家畜育种

一、分子生物技术与分子育种

进入20世纪80年代中后期以来，随着各种分子生物技术的出现,动物遗传育种进入了分子水平，即分子育种，使育种朝着快速改变动物基因型的方向发展。分子育种克服了年龄、性别、组织及各种内外环境因素的影响，而且所提供的遗传差异，即遗传标记的种类又非常多，因此分子育种越来越受到人们的重视。采用分子育种，可使培育动物新品种的时间由过去的8-10代缩短到2-3代，其主要方法是对主要经济性状进行基因定位，通过参考群动物用遗传连锁法和候选基因法测定数量性状座位的主效基因以及DNA分子遗传标记法的辅助选择，这些措施的综合应用，可以大大提高经济性状的选择进展，加快品种的改良和新品种的培育速度。第四十五页，共六十一页，2022年，8月28日

二、标记技术的发展1.形态学标记：主要指一些具有鲜明外部特征的质量性状，并且可以通过表型来推断基因型，如毛色、牛角的有无等。2.细胞学标记：指染色体形态、数目和结构的变异。3.生化标记：血液或乳中蛋白质、酶的多态性，这种多态性可以通过免疫反应或电泳技术反映出来，并由此判断其基因型。4.分子标记：在某些基因位点上，不同个体间的DNA序列存在差异，从而表现出多态性。主要的标记有RFLP、AFLP、RAPD、微卫星DNA、DNA指纹技术、SNP等。第四十六页，共六十一页，2022年，8月28日1.DNA指纹(DNAfingerprint,DFP)技术。2.限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)技术;指用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，所得的含有同源序列的酶切片断在长度上所存在的差异，这种差异的产生是由于DNA序列中个别碱基的变异而造成某个限制性内切酶酶切位点的产生或丢失。三、分子生物技术的类型第四十七页，共六十一页，2022年，8月28日TherewasatimewhentoamplifyDNA,Youhadtogrowtonsandtonsoftinycells.

ThenalongcameaguynamedDr.KaryMullis,Saidyoucanamplifyinvitrojustaswell.

Justmixyourtemplatewithabufferandsomeprimers,Nucleotidesandpolymerases,too.

Denaturing,annealing,andextending.Wellit’samazingwhatheatingandcoolingandheatingwilldo.

PCR,whenyouneedtodetectmutations.PCR,whenyouneedtorecombine.PCR,whenyouneedtofindoutwhothedaddyis.PCR,whenyouneedtosolveacrime.

(repeatchorus)

ThePCRSong第四十八页，共六十一页，2022年，8月28日3.PCR技术(polymeasechainreaction,PCR)基础上衍生的许多方法.如

RAPD技术(randomamplifiedpolymorphicDNA):

扩增所用的引物是随机引物，一般10~20个核苷酸，对基因组DNA进行PCR扩增后，可以获得长度不同的多态性DNA片断。该标记重复性差、呈共显性标记。

RAPD电泳图谱第四十九页，共六十一页，2022年，8月28日

扩增长度多态性(amplifiedlengthpolymorphism,AFLP)：指通过特定引物和PCR复制并扩增不同个体基因组DNA模板后,所得扩增片断在长度上的差异。造成差异的原因：不同个体的DNA序列存在差异，在复制特定的DNA序列时所需的引物也可能不同，同一引物可诱导某一个体的DNA片断得以复制，而在另一个体中就可能不能诱导。该标记不能区分纯合子和杂合子。第五十页，共六十一页，2022年，8月28日微卫星DNA标记(microsatelliterepeats)：又称为简单重复序列，重复单位1~6个碱基对，重复次数在10~20次。单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)：由于单个核苷酸的突变导致的多态性。小卫星DNA标记(minisatelliteDNA);单链构型多态性标记(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)等。

RAMP技术(randomamplifiedmicrosatellitepolymorphism,RAMP);特异性扩增多态性(specificamplifiedpolymorphism,SAP)第五十一页，共六十一页，2022年，8月28日微卫星位点扩增图谱第五十二页，共六十一页，2022年，8月28日PCR扩增图谱SSCP扩增图谱第五十三页，共六十一页，2022年，8月28日PCR-RFLP扩增图谱SSCP扩增图谱第五十四页，共六十一页，2022年，8月28日第五十五页，共六十一页，2022年，8月28日4.差异显示（differentialdisplay）技术。5.DNA序列分析技术。6.线粒体DNA的限制性片段长度多态性（mitochondrialDNArestrictionfragmentlengthpolymorphism,mtDNARFLP）；第五十六页，共六十一页，2022年，8月28日四、连锁图谱（Linkagemap）两个位于同一染色体上的基因座位称为彼此连锁，将这两个彼此连锁的基因按其排列顺序以及相互间的遗传距离线性排列，即为基因的连锁图谱或遗传图