园艺植物组织培养-第2章

第二章实验设备及培养条件2023/2/2HuoXW,IMAU实验室

培养条件OUTLINE2023/2/2HuoXW,IMAU

一个标准的组织培养实验室应当包括：洗涤室、配置室、无菌室、培养室、观察室等。在实际中可结合可行条件，合并一部分。一、洗涤室(clean-uproom)二、准备室(mediapreparationroom)三、接种室(transferroom,sterilizedroomorachamberfortransferringcultures)四、培养室(culturegrowingroom)第一节实验室

2023/2/2HuoXW,IMAU光照培养室2023/2/2HuoXW,IMAU接种室2023/2/2HuoXW,IMAU一、洗涤室(clean-uproom)二、准备室(mediapreparationroom)

准备室还应配备以下仪器设备：(1)工作台(2)药品柜(3)普通冰箱(4)电子分析天平和托盘天平电子分析天平(5)电蒸馏水器(6)磁力搅拌器(7)恒温水浴锅(8)电炉或电饭锅(9)酸度计(10)培养基分装设备(11)高压灭菌锅(12)恒温培养箱(13)烘箱2023/2/2HuoXW,IMAU三、接种室(transferroom，sterilizedroom)接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。接种室应设有缓冲间，面积2平方米为宜。2023/2/2HuoXW,IMAU接种室的主要设备及用具有：(1)接种箱(2)超净台Sterilizedfacility(3)解剖镜(4)无菌操作用的器具

按单人超净台上用量有：酒精灯1个；20-25cm长的医用镊子1把；解剖刀；医用剪；广口瓶，内放酒精，用于浸泡镊子、刀、剪等；用于架放灼烧过的刀、镊子的小架。

2023/2/2HuoXW,IMAU四、培养室(culturegrowingroom)培养架:培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27℃左右.室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70％-80％为好。控制日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。2023/2/2HuoXW,IMAU第二节培养条件

在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。2023/2/2HuoXW,IMAU一、温度(temperature)不同植物繁殖的最适温度不同，大多数在20--30℃，通常控制在（25+2）℃恒温条件下培养。温度过低（≤15℃）或过高（>35℃）都会抑制细胞、组织的增殖和分化，不利于培养物生长。一些例外情况。利用细胞培养、低温保存植物资源时，可在-196℃条件下限制其生长，延长存储时间。不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20℃、月季是25-27℃，番茄是28℃。温度影响植物组织培养育苗的生长速度，分化增殖、器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28℃为最好，在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。2023/2/2HuoXW,IMAU不同培养目标采用的培养温度也不同。

百合鳞片在30-C以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25℃以下的高。桃胚在2-5℃条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3-5d，可得到无病毒苗。低温预处理利于培养。在烟草花药培养中，在5℃下预处理48h后进行培养，能促进体细胞的形成。在确定某种培养物的适宜温度时，要考虑原植物的生态环境才能获得最佳效应。例如，生长在高海拔和较低温度环境下的松树，若在较高温度下培养，试管苗生长十分缓慢。2023/2/2HuoXW,IMAU二、光照(1ight)1．光照强度(1ightintensity)光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。一般培养室要求光照12—16h/d，光照度1000-5000lx。不同的培养物对光照有不同的要求。一些植物（如荷兰芹）的组织培养中，其器官形成不需要光；而另一些植物，如黑穗醋栗，光条件下可显著提高其幼苗的增殖。同一种植物对光照的要求也不同。百合原球茎在暗培养下长出小球茎，在光照条件下长出叶片。对短日照敏感的葡萄品种，其茎段的组织培养只有在短日照条件下才能形成根；对日照强度不敏感的品种则在任何光周期下都能生根。2023/2/2HuoXW,IMAU2.光质(lightwave)光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。不同的光波对器官分化关系密切。例如，在杨树愈伤组织的生长中，红光有促进作用，蓝光则有抑制作用。而蓝光明显促进绿豆下胚轴愈伤组织的形成。在烟草愈伤组织的分化培养中，起作用的光谱主要是蓝光区，红光和远红光有促进芽苗分化的作用。在试管苗生长的后期，加强光照强度，可使小苗生长健壮，提高移苗成活率。2023/2/2HuoXW,IMAU3．光周期(1ighperiod)最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。一般来说，黑暗条件下有利于细胞、愈伤组织的增殖，但器官的分化往往需要一定的光照。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织。有的植物需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在黑暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。2023/2/2HuoXW,IMAU三、湿度(humidity)

湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件。培养容器湿度常可保证100%环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，组织培养室内一般要求保持70%—80%的相对湿度环境湿度过高、过低都不利于培养物生长：过低会造成培养基失水干枯而影响培养物的生长分化；过高会造成杂菌滋长导致大量污染。湿度不够可经常拖地或利用保湿机，湿度过高可利用去湿机或通风除湿。2023/2/2HuoXW,IMAU四、渗透压(penetratingpressure)渗透压影响植物细胞的脱分化和再分化及器官的形成。植物细胞和培养基之间处于等渗或略低于培养及的渗透压时，才利于汲取养分和水分。培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物影响到渗透压的变化。多数植物适宜的糖浓度为2-6%。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。2023/2/2HuoXW,IMAU五、pH值外植体的培养增殖都要求一定的pH值。通常培养基的pH值以在5.4～6.0之间较好。如果pH值不适则直接影响外植体对营养物质的吸收，进而影响外植体的脱分化、增殖和器官形成。不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8.

不同植物的最适PH值

种类最适PH值种类最适PH值

杜鹃4．0月季5．8

越桔4．5胡萝、石刁柏6．0

蚕豆5．5桃7．0

番茄、葡萄5．72023/2/2HuoXW,IMAUpH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高一些。当pH值高于6.5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。高温灭菌会降低pH值(约0.2-0.3个pH值)因此在配制时常提高pH值0.2-0.3单位。pH值大小调整可用0.1M的NaOH和0.1M的HCI来调整。lml的NaOH可使pH值升高0.2单位，lml的HCI可使pH值降低0.2单位。2023/2/2HuoXW,IMAU六、气体(Oxygen)氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。

在接种时应避免把整个外植体全部埋人琼脂中，否则造成缺氧窒息。2023/2/2HuoXW,IMAU胡萝卜细胞悬浮培养有两种再生植株的途径：先形成根再长成小植株，形成胚状体后再成苗。与液体培养基中存在的氧浓度有关，当培养基中氧浓度低于临界水平时，促进形成胚状体，当氧浓度高于临界水平，则有利于形成根。氧对器官的发生可能有重要的调节作用。2023/2/2H