实验二十一细菌的芽孢和荚膜染色法fg

实验二十一细菌的芽孢和荚膜染色法

一、实验目的：

1、继续学习微生物涂片的制作方法；2、掌握芽孢、荚膜染色的基本原理及方法。

二、实验原理：

芽孢、荚膜染色法都是利用细菌

各部位（分）的构造不同，它们对染料的亲和力也不同。因此，可以采用各种特殊染色方法，使细菌细胞的不同构造能在显微镜下显示出来，便于观察和区别。

三、实验材料：

1、菌种：枯草杆菌、钾细菌；2、染色液：孔雀绿、蕃红溶液、碳素墨水、甲醇、生理盐水等；3、器材：试管夹、酒精灯、接种针、载玻片、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸等。

四、方法及步骤：

1、芽孢染色法：某些细菌（革兰氏染色阳性杆菌）生长到一定时间（对数期后期），在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的结构，这种结构称为芽孢，由于在细胞内也叫内生孢子。

芽孢的特点是不能繁殖，休眠体，含水少、含脂高、不透明，对外界环境有很强的抵抗能力，有的芽孢在一定条件下可保持活力数年甚至数十年之久，芽孢尤其能耐高温，像枯草杆菌的芽孢，在沸水中可存活1小时，破伤风芽孢杆菌可存活3小时，而肉毒梭状芽孢杆菌的芽孢可忍受6小时，即使在180℃干燥箱中仍可存活10分钟，这主要是2.6-吡啶二羧酸与钙的复合物占芽孢干重5-15%的原理。芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节，它还是检验培养基灭菌彻底不彻底的依据。芽孢染色的原理是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。细菌的芽孢壁比营养细胞的细胞壁厚，致密、透性低，着色和脱色都比营养细胞困难。因此，一般采用一种碱性染料（孔雀绿）并在微火上加热或延长染色时间。我们采用加热的方法，使菌体和芽孢同时都染上色后，再用水冲洗脱去菌体的染料，此时仍保留芽孢的颜色，并用对照染料来染菌体，这样就将芽孢和菌体分别染成两种不同的颜色。其步骤如下：⑴取枯草杆菌制成涂片、干燥、固定；⑵用试管夹夹住玻片的一端，在涂片上滴加孔雀绿3-4滴；⑶加热5分钟使冒蒸汽，切勿煮干；⑷冷却、水洗（细水）；⑸蕃红溶液复染2-3分钟，水洗；⑹干燥、镜检；⑺结果：芽孢呈绿色，菌体呈红色。芽孢的孔雀绿染色2、荚膜染色法：有些细菌生活在一定营养条件下，可向细胞壁表面分泌一层松散透明、疏松、柔软、粘度极大，粘液状或胶质状的物质即为荚膜。荚膜的化学成分，主要是多糖、多肽、蛋白质、脂以及由它们组成的复合物-脂多糖、脂蛋白等。荚膜虽不是细胞的主要结构，但它是细胞外碳源和能源性贮藏物质，并能保护细胞免受干燥的影响，同时能增加默某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬细胞的吞噬。产荚膜细菌，常常给生产带来麻烦，食品工业中的粘性面包，粘性牛奶，都是由于染了此类细菌引起的，对制糖工业威胁更大，由于产荚膜细菌的大量繁殖，增加了糖液粘度，影响了过滤速度，使生产蒙受损失。但在一定条件下，有害的东西可变为有益的物质，如肠膜明串珠菌，在人为控制下，让其利用蔗糖合成大量产荚膜物质—葡聚糖。葡聚糖是生产右旋糖酐的原料，而右旋糖酐是带代血浆的主要成分，具有维持血液渗透压和增加血溶量的作用，临床上还用于抗休克、消肿和解毒，所以在医学上十分重要。荚膜比菌体要大。其染色原理是荚膜包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，它是由多糖类衍生物、糖原或多肽所聚积而成，此层对染料结合力很弱，因此不易染色，故一般采用负染色的方法，使细菌和背景着色，背景与菌体之间形成一透明区即荚膜，便于观察，由于荚膜很薄，容易变形，在制片是一般不用加热固定。其步骤如下：方法一.⑴取钾细菌一环，做成涂片，自然干燥（不能加热干燥）；→⑵碳素墨水（用平整载玻片顺菌液刮过）；→⑶风干；⑷甲醇固定；⑸水洗；→⑹蕃红溶液1-2分钟；→⑺自然干燥、镜检；→⑻结果：背景黑色、荚膜无色、菌体红色。方法二.取少许菌苔与一滴无菌水，在玻片上混合，摊平，待自然风干后，用石炭酸复红染液染2～3min，水洗（注意水不要直接冲洗涂菌处），用滤纸吸干。镜检，菌体红色，荚膜为淡红色。

五、绘图：绘芽孢染色、荚膜染色的结果；六、预习：

放线菌、霉菌、酵母菌的形态观察

实验二十二放线菌、霉菌、酵母菌的形态观察一、实验的目的学习和掌握观察放线菌、霉菌形态的基本方法，并观察它们的个体形态特征。二、实验原理

1、放线菌：放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状原核生物，因菌落呈放射状而得名。

放线菌的菌落在培养基上着生牢固，不易被接种针挑取，由于孢子的存在，常使菌落表面呈粉末状。它和细菌单染色一样，可用石炭酸复红和吕氏美蓝等染料着色后，在显微镜下观察它们的形态。放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所组成的单细胞菌丝体，菌丝内无隔膜，菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（基内菌丝）和有营养菌丝向上生长的气生菌丝，有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋状、波浪形或分枝状等，着生形式有丛生、互生和轮生三种。孢子的表面光滑或粗糙，圆或椭圆和干形。孢子有各种颜色。这些形态特点都是鉴别放线菌的重要依据。

⑴营养菌丝：又叫初级菌丝体或一级菌丝体，匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物，故亦称基内菌丝。营养菌丝一般无隔膜，直径0.2—0.8µ，但长度相差很大，短的小于100µ，长的可达600µ以上，有的无色素，有的产生黄、橙、红、紫、兰、绿、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，还可透入培养基内，将培养基染上相应的颜色，如果是非水溶性（脂溶性）色素，则使菌落呈现相应的颜色，因此，色素是鉴定菌种的重要依据。⑵气生菌丝：又称二级菌丝体。营养菌丝体发育到一定时期，长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。⑶孢子丝：当气生菌丝体发育到一定程度，其上分化出可形成孢子的菌丝即孢子丝，又名产孢丝或繁殖丝。放线菌最突出的特性之一是产生大量的、种类繁多的抗生素，根据估计，全世界共发现4000多种抗生素，其中绝大部分是由放线菌产生的。2、霉菌：霉菌是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。凡是在基质上长成毛状、棉絮状或蜘蛛网状的丝状真菌统称霉菌。霉菌形态比细菌、放线菌复杂，个体比较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。因此，在观察是要注意菌丝的直径大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖或有性繁殖时形成的孢子是哪一种，孢子是怎样着生的。由于霉菌的菌丝较粗大，而且孢子容易飞散，如将菌体置于水中容易变形，故观察时状不用水浸法制片，而将菌体置于乳酸石炭酸棉兰染液中，使细胞不易干燥，并有杀菌作用。三、材料1、菌种：5406放线菌、青霉菌、黑曲霉、根霉、酵母菌；2、染料：石炭酸复红、0.1%吕氏美蓝、乳酸石炭酸棉兰；3、器材：载玻片、盖玻片、酒精灯、镊子、接种针、接种铲等。四、方法及步骤1、放线菌：用接种铲切取5406放线菌一块（带有培养基）→在载玻片上轻压一下，弃去培养基，制成印