wzc高级生化4-蛋白质的分离

第六节

蛋白质的分离纯化和分析1一、蛋白质分离纯化的一般程序

（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。1.机械破碎法——利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2.渗透破碎法

——在低渗条件使细胞溶胀而破碎。23.反复冻融法

生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。该法简单方便，但对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4.超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5.酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。3(二)蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等应根据性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（SDS、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。4蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。

性质方法分子大小——透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤溶解度——等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀电荷——电泳、离子交换层析吸附性质——吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）特异性结合——亲和层析5蛋白质的分离纯化方法分子大小透析和超过滤：透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。凝胶过滤：即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。溶解度等电点沉淀和pH控制盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水化水。温度沉淀：温度对溶解度有影响，低温稳定，高温不稳定。在0-40℃，大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。6蛋白质分离纯化方法电荷电泳（净电荷、分子大小、形状）区带电泳聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）毛细管电泳离子交换层析等电聚焦：外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。层析聚焦：层析柱中建立连续的pH梯度，蛋白质样品由柱上端随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点pH处，形成区段。吸附：吸附层析，吸附剂（硅石、氧化铝、活性碳）和疏水吸附剂，与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。特异亲和力：亲和层析其它：如高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC）7（三）蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离。主要根据蛋白溶解度的差异。1.等电点沉淀法2.盐析法分步盐析分离不同蛋白质。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3.有机溶剂沉淀法如乙醇、丙酮等，它们的介电常数比水低，能降低球状蛋白质溶解度;有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。有机溶剂会使蛋白质变性，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。8（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。9纯化方法1.

凝胶过滤法

(GelFiltrationChromatography，GFC)也称凝胶过滤或分子排阻层析。这是根据分子大小分离蛋白质混合物有效的方法之一。凝胶过滤所用的介质一般是:交联葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶Sephacryl10（1）葡聚糖凝胶商品名Sephadex它由线形α－1，6－葡聚糖和3-氯-1,2环氧丙烷以醚键相互交联而成的化合物。通过控制葡聚糖和交链剂的比例及反应条件决定其交联度的大小，从而得到各种规格的葡聚糖凝胶。用G表示交联度，G越小，交联度越大，凝胶中网眼越小，吸水量就越小。11葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒，在显微镜下放大700倍，可见其表面的网状皱纹。它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。由于各种型号的葡聚糖凝的交联度(交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分数)不同，致使其在水中的膨胀度(床体积)、吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀所需的水量。但不包括颗粒间所带的水量)、筛孔的大小和分级范围有明显的差异。例如，SephadexG—25比G—100交联度大。而影胀度、吸水量和筛孔直径前者小于后者。另外，前者对球形蛋白分级范围较窄。即在1000(下限)一5000(上限)之间，而后者范围较宽，即在4000—150000之间。12表Sephadex1的种类与特性型号分离范围（分子量）最小溶胀时（h）20℃～25℃100℃G10＜7001.0±0.13

12~3G15＜15001.5±0.23

12.5~3.5G25＜50002.5±0.23

14~6G501500～200008.0±0.33

19~11G753000～700007.5±0.524

112~15G1004000～15000010.0±1.072

115~20G1505000～80000015.0±1.5

72

120~30G2005000～300000020.0±2.072

130~40）床体积（ml）/干凝胶（mg吸水量（ml/g）13Sephadex的稳定性

葡聚糖凝胶在水、盐、碱、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的，不溶解的，而且很少产生化学降解。在中性条件下，葡在0．1m01／LHCl溶液中浸泡1—2小时，甚至在0．02m01／LHCl溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。但是，当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。不然，微生物将生长。14吸附性：

葡聚糖凝胶系弱酸性物质。这是由于其每克干胶中含10—20微克当量的羧基基团所致。该基团能与分离物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。但是，这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克服。当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。因此进行葡聚糖凝胶层析时，常用含有NaCL的缓冲液作洗脱液。

15新的葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响。此外，葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集家具有较强的吸附作用，若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸附原理，而不是排阻原理。16（2）琼脂糖疑胶琼脂糖是从琼脂中分离出来的。在制备过程要尽可能将其中硫酸根和羧基基团的琼脂胶除去，才能得到不带电荷基团的琼脂糖。琼脂糖是由D—半乳糖和3、6脱水的L—半乳糖连接构成的多糖链。这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到45℃以下时，它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。17琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异瑞典称Sepharose美国称Bio－gelA英国称Segavac中国的同类产品与瑞典相同。这些琼脂糖中除Segavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售。18琼脂糖凝胶对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力；在pH4.4-9.0的缓冲液中稳定。室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶。琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故放在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose2B(2％浓度)、4B和6B(6％)。Sepharose6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B.19

Sepharose与1，3—二溴异丙醇在强碱性条件下反应后，即生成CL-型交联琼脂糖。这种琼脂糖的筛孔与同浓度的未交联的琼脂糖相同，但热稳定性和化学稳定性大大提高。CL-型交联琼脂糖可在广范围的pH溶液中使用(pH3～13）,即使较强的碱溶液短时间处理，期性能也不会改变。但在氧化剂存在时，会有少量的多糖链发生解聚。琼脂按凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好。20产品名称规格特性及应用价格琼脂糖凝胶FF100ml用于大分子蛋白、超螺旋DNA、病毒纯化等生物大分的分离纯化。包括这些样品的除盐等。分离范围1x104-41x106￥600琼脂糖凝胶FF500ml￥200021（3）聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio—ge1。它是以甲撑双丙烯胺胺(双体)作交联剂，以过硫酸铵作催化剂，在N、N、N’、N’—四甲基乙二胺(TEMED)加速剂的作用下，将丙烯酰胺(单体)聚合而成的。当改变单体浓度时，就可得到吸水串不同的产物。商品聚丙烯酰胺凝胶型号有Bio—ge1P—2到P—300，其阿拉伯数字相当于排阻限度的10—2。22一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀。该凝胶不溶于水和普通有机溶剂，能忍受浓盐、尿素和服盐等溶液的浸泡；在pHl—10或短时间超过此pH范围的溶液中较稳定；要避免长期与强酸和强碱接触，如果与其接触，并在高温条件下，酰胺基将迅速发生分解。聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，如使用离子强度略高的洗脱液操作，此弊病可以克服。23（4）SephacrylSephacryl是由烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联制成的。此凝胶属硬性凝胶，它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。Sephacryl吸水时，其珠状颗粒直径平均值为70μm，通常是用于水相系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。它在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少；它可在pH2—11范围内使用，当pH低时，葡聚糖链将发生少许水解作用；在0.2mol/LNaOH溶液中(室温下)处理100小时，对其低流速和多孔性没有明显影响。用清洁剂(如SDS)、6mol／L盐酸胍和8尿素溶液作洗脱剂，高温消毒(120℃,

pH7)处理后，层析性质没有明显变化。24分子筛效应：大分子先洗脱下来小分子后洗脱下来25也叫凝胶过滤层析26凝胶过滤色谱原理

凝胶层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

27Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。28在同一凝胶柱上分离Mr不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。29流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开了。30其分离效果受操作条件（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）的影响，而最直接的影响是Kav值的差异性，Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。分配系数Kav既是判断分离效果的一个参数，又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要测出床体积Vt和外水体积Vo以及洗脱体积Ve，即可计算出Kav值。31凝胶床总体积Vt可用二种方法得到：计算法：根据层析柱体积计算总体积，可用下列公式表示Vt=r2h式中r为层析柱半径；h为凝胶床高度；为圆周率。在用此公式计算凝胶床总体积时，须精确地分段测量，以防内径不匀造成误差。另外还须注意到，在层析过程中，尤其是软胶的操作压力要小，以防凝胶床的高度降低。

测量法：由凝胶床的组成可知，床体积Vt等于外水体积Vo、内水体积Vi与凝胶颗粒实际占有体积Vg之和。即Vt=V0+Vi+Vg因Vg与Vt相比很小，可忽略不计，故Vt=V0+Vi32Vo和Vi可通过实验测得：

当把分子量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在内水体积和外水体积中的分布是不一样的。溶液中的分子大于凝胶孔径上限者不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水体积。即Ve=Vo(Kav=0)。然而，溶液中的分子小于凝胶孔径下限者能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积，即Ve=Vt=Vo+Vi(Kav=1)。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则能进入部分凝胶网孔中，故其洗脱体积Ve是在Vo和Vt之间（Kav在0-1之间）。33测定外水体积的物质——通常选用蓝色葡聚糖2000。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积（Vi）的物质——可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。34凝胶色谱实验方法与步骤1.葡聚糖凝胶的预处理取3克葡聚糖凝胶（Sephadex-25）干粉，浸泡于50ml蒸馏水中充分溶胀（室温，12h），然后反复倾斜除去表面的悬浮微粒，再加入pH7.0磷酸缓冲液沸水浴中2-3h去除颗粒内部空气，最后加入pH7.0磷酸缓冲液浸泡过夜备用。2.装柱(1)将层析柱垂直固定在铁架台上,不要颠倒；(2)将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约1-2cm高的缓冲液，把溶胀好的糊状凝胶边搅拌边倒入柱中，最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。最后放入略小于层析柱内径的圆形滤纸片，以防将来加样时凝胶被冲起。35

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