【课件】3.2基因工程的基本操作程序（第2课时）课件（人教版2019选择性必修3）

3.2基因工程的基本操作程序-2新教材•人教版•选择性必修三【教学过程】TeachingProcess1.概念图3.教学总结、综合2.课堂教

学内容4.课堂练习巩固典型习题规律总结探究•实践建立模型基本步骤1.转化指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。2.转化的受体细胞三.将目的基因导入受体细胞受体细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法冠瘿瘤农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等。2.转化的受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞①农杆菌转化法三.将目的基因导入受体细胞为什么农杆菌容易感染双子叶植物？科学研究发现，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成，单子叶植物通常没有。2.转化的受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞①农杆菌转化法三.将目的基因导入受体细胞A.载体：B.受体细胞：农杆菌Ti质粒（T-DNA)主要是双子叶植物和裸子植物农杆菌Ti质粒随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。2.转化的受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞①农杆菌转化法三.将目的基因导入受体细胞构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒表现出新性状的植株导入植物细胞植物细胞将目的基因插入染色体DNA中目的基因Ti质粒T-DNA含重组Ti质粒的农杆菌转入农杆菌C.过程农杆菌转化法示意图Ti质粒目的基因构建基因表达载体转入农杆菌导入植物细胞T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中表达新性状2.转化的受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞①农杆菌转化法三.将目的基因导入受体细胞D.转化的具体方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片__________________，然后________________，并_____________；受体细胞为_______与农杆菌共培养筛选转化细胞再生成植株体细胞b.可以将_______直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；受体细胞为_______花序含有农杆菌的溶液种子筛选鉴定受精卵2.转化的受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞①农杆菌转化法三.将目的基因导入受体细胞例1.该过程经过____次拼接、____次导入？(1)第一次拼接___________________________(2)第二次拼接______________________________________________________(3)第一次导入___________________________(4)第二次导入___________________________将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）两两将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）Ti质粒目的基因构建基因表达载体转入农杆菌导入植物细胞T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中表达新性状三.将目的基因导入受体细胞例1.该过程经过____次拼接、____次导入？(5)用农杆菌感染时，优先选择

（受伤的/完好的）叶片与重组质粒的农杆菌培养，选用该叶片的理由是

。受伤的叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌(6)若要利用农杆菌转化法转化单子叶植物细胞，可采取添加

，其目的是

。(7)利用Ti质粒构建重组质粒的目的是：

。酚类物质吸引农杆菌移向受体细胞，有利于目的基因成功转化将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA上，利用其将目的基因导入受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上，使目的基因的遗传特性稳定维持和表达两两三.将目的基因导入受体细胞B.在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。如A.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②花粉管通道法我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法2.转化的受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞C.实例:将Bt基因导入棉花细胞三.将目的基因导入受体细胞①方法：显微注射法②操作程序：取受精卵显微注射移植到同期发情的母畜子宫内为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？提纯基因表达载体2.转化的受体细胞（2）将目的基因导入动物细胞三.将目的基因导入受体细胞③拓展：【其他方法】科学家也用病毒DNA

与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如慢病毒载体、腺病毒载体等。2.转化的受体细胞（2）将目的基因导入动物细胞三.将目的基因导入受体细胞腺病毒载体新冠疫苗的制备将编码新冠病毒刺突蛋白（S）基因插入腺病毒基因组中，接种后，随载体增殖，大量所需的抗原得以表达。接种疫苗，责无旁贷！2.转化的受体细胞（2）将目的基因导入动物细胞三.将目的基因导入受体细胞①受体细胞：微生物（常用大肠杆菌）优点：繁殖周期短体积小易于培养操作多为单细胞遗传物质相对较少②方法流程：大肠杆菌CaCl2感受态细胞溶于缓冲液中的重组DNA分子转化2.转化的受体细胞（3）将目的基因导入微生物细胞三.将目的基因导入受体细胞③实例：利用转基因大肠杆菌生产药物原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。2.转化的受体细胞（3）将目的基因导入微生物细胞三.将目的基因导入受体细胞种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法；花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子【小结】三.将目的基因导入受体细胞检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；2.检测内容及方法:类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状病原体接种实验等四.目的基因的检查与鉴定1.目的:DNA分子杂交法：

其基本原理是具有一定同源性的两条DNA单链，在一定条件下（适宜的温度等）可以按照碱基互补配对原则形成双链。杂交过程中，杂交的双方是待测的DNA和用放射性同位素标记的已知DNA片段（又称为基因探针）。若待测DNA中有能与探针互补的四.目的基因的检查与鉴定特异性DNA片段，用于示踪的放射性同位素标记会指示出其所在的位置，表明目的基因已插入转基因生物染色体的DNA中（如图)。探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够________________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；热变性调节温度自动调控温度30②PCR扩增DNA片段还利用了_________________的原理；DNA半保留复制基因工程的基本操作程序（2）DNA片段电泳鉴定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____；可解离的基团pH电场带电分子电泳与它所带电荷相反②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、________________和_____等有关④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的______下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳凝胶的浓度染色300nm紫外灯DNA分子的大小构象基因工程的基本操作程序2.材料用具①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）基因工程的基本操作程序10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量为1pg-1μg）5～10μL总体积50μL⑧PCR反应体系的配方⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等基因工程的基本操作程序

使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。3.方法步骤（1）DNA片段的扩增①移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分②离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）③反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min预变性：基因工程的基本操作程序（2）DNA片段的电泳鉴定①配制琼脂糖溶液

根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀②制备凝胶A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。基因工程的基本操作程序3.方法步骤③加样

将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物④电泳

接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳⑤观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相（2）DNA片段的电泳鉴定基因工程的基本操作程序3.方法步骤注意:①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。

②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

⑤在进行操作时，一定要戴好一次性手套。

⑥PCR扩增不能随意加大试剂用量。基因工程的基本操作程序3.方法步骤4.结果分析与评价(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。

可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。

如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。基因工程的基本操作程序3.个体生物学水平的鉴定具体方法举例转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常四.目的基因的检查与鉴定1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？

科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。

到社会中去2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？

科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。

到社会中去（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。

到社会中去

这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全生评价等。

到社会中去一.概念检测1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（

）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（

）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（

）√××练习与应用（P83）一.概念检测2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（

）A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸D练习与应用（P83）二、拓展应用1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。练习与应用（P64）二、拓展应用2.八氢