甾体激素类药物的分析

甾体激素类药物的分析基本要求1．掌握甾体结构类药物的结构特点与分析方法之间的关系。2．掌握甾体类药物的鉴别原理与方法。3．掌握甾体类药物的含量测定原理与方法。4．熟悉甾体类药物杂质检查的方法。2021/3/102基本结构：环戊烷骈多氢菲

概述

甾体激素类药物的母核是由A、B、C、D四个环组成的。环上碳原子编号：1－17。D环：环戊烷结构A、B、C环：全氢化菲（菲烷)菲

所以甾体激素类药物的母核叫环戊烷骈多氢菲。2021/3/103分类：甾体激素肾上腺皮质激素性激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌激素2021/3/104雌二醇

黄体酮

睾丸素

皮质酮

2021/3/105

肾上腺皮质激素天然的皮质激素——氢化可的松2021/3/106肾上腺皮质激素醋酸地塞米松2021/3/107肾上腺皮质激素曲安息龙2021/3/108肾上腺皮质激素地塞米松磷酸钠2021/3/109雄性激素甲睾酮2021/3/1010雄性激素丙酸睾酮2021/3/1011蛋白同化激素苯丙酸诺龙2021/3/1012孕激素黄体酮2021/3/1013孕激素醋酸甲地孕酮2021/3/1014雌性激素雌二醇2021/3/1015雌性激素炔雌醇2021/3/1016炔诺酮此外2021/3/1017炔诺孕酮2021/3/1018一、结构与性质

1.肾上腺皮质激素主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂

反应

C17

–

α–醇酮基还原性2021/3/1019

此反应首先是N-H键断裂和与羰基加成，然后再脱去一分子水生成肟或腙。2021/3/1020

醛、酮与2，4-二硝基苯肼作用生成的2，4-二硝基苯腙是黄色结晶，具有一定的熔点，反应也很明显，便于观察，所以常被用来鉴别醛、酮。其它反应的产物肟、腙大都也是具有一定熔点的晶体，亦可用来鉴别醛、酮。因此，把这些氨的衍生物称为羰基试剂（即检验羰基的试剂）。2021/3/10212.雄性激素及蛋白同化激素主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应

C17–

β–羟基可成酯2021/3/10223.孕激素主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应C17–甲酮基与亚硝基铁氰化钠反应2021/3/10234.雌性激素主要活性基团性质A环为3–OH苯环UV、与重氮苯磺酸盐反应C17–乙炔基与AgNO3反应C17–羟基可成酯2021/3/1024香2021/3/1025特臭特臭2021/3/1026二、鉴别试验（一）与强酸的呈色反应甾体激素类药物呈色H2SO4H3PO4HClO4HCl（母核）2021/3/1027与硫酸显色反应

药品名称显色荧光加水稀释后

泼尼松龙深红红色消失灰色絮状↓

泼尼松橙色黄→蓝绿

炔雌醚橙红黄绿

↓红色炔雌醇橙红黄绿絮状↓玫红醋酸可的松黄或微褪色并澄清带橙色2021/3/1028(二)官能团的反应肾上腺皮质激素药物呈色四氮唑盐OHˉ1、C17

–

α–醇酮基还原性呈色反应此外还有与斐林试液、多伦试液的沉淀反应2021/3/1029甾酮类激素药物呈色羰基试剂2.C3–酮基和C20–酮基＃常用的羰基试剂：2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼2021/3/1030异烟腙（黄色）睾酮Forexample：2021/3/1031黄体酮异烟双腙（黄色）2021/3/1032具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物呈色亚硝基铁氰化纳间二硝基酚芳香醛3.甲酮基2021/3/1033黄体酮蓝紫色亚硝基铁氰化纳其他甾体淡橙色不显色2021/3/1034蓝紫色2021/3/1035有机氟Fˉ有机破坏有机氯Clˉ4.有机卤素茜素氟蓝硝酸亚铈硝酸—硝酸银AgCl↓

呈色2021/3/1036茜素氟蓝蓝紫色F-2021/3/1037雌激素类药物红色偶氮染料重氮苯磺酸5.酚羟基2021/3/1038含炔基的甾体激素银盐沉淀硝酸银6.乙炔基的沉淀反应↓2021/3/1039炔雌醇白2021/3/1040

(三)制备衍生物测定m.p.盐酸氨基脲4ml，30min苯丙酸诺龙50mg缩氨基脲衍生物缩氨基脲的生成m.p.约182℃甲醇2ml溶解水浴上浓缩，冷却，滤过沉淀用甲醇洗，水洗，105℃干燥2021/3/1041△４-3-酮、苯环、其他共轭结构（四）UV法1.结构依据240nm左右280nm左右2021/3/10422021/3/10432.应用示例曲安西龙丙酸倍氯米松

溶剂甲醇乙醇20μg/ml浓度20μg/ml结果判断在238nm处有最大吸收在239nm处有最大吸收，A为0.57～0.60，在239nm与263nm处的吸收度比值为2.25～2.452021/3/1044结构特征：酚羟基、C17–OHC17–乙炔基炔雌醇（五）IR法2021/3/10451505cm-1ν3505cm-13300cm-11590cm-13610cm-1ν酚羟基醇羟基1615cm-1苯环的骨架振动炔基伸缩振动亚甲基、角甲基吸收带2021/3/1046黄体酮结构特征：△４-3-酮、C17-酮基2021/3/10471700cm-1C=O20位酮基1665cm-13位酮基1615cm-1870cm-1C-H双键2021/3/1048（七）TLC法

主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别

方法：对照品法要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。2021/3/10491、溶液的配制Forexample:

醋酸泼尼松片的鉴别

样品液对照液2、色谱条件薄层板：硅胶G点样：样品液和对照液各5l展开剂：二氯甲烷-乙醚-甲醇-水（385∶60∶15∶2）显色剂：碱性四氮唑蓝试液3、判断样品液主斑点的颜色及位置应该与对照液主斑点相同。2021/3/1050Anotherexample:丙酸睾酮注射液的鉴别

取本品约相当于丙酸睾酮10mg无水乙醇10ml强力振摇冰浴静置分层，取上层离心，上清液作为供试品液另取丙酸睾酮对照品无水乙醇制备1mg/ml的对照溶液1、溶液的配制样品液对照液2、色谱条件薄层板：硅胶GF254点样：样品液和对照液各10l展开剂：二氯甲烷-甲醇（19∶0.5）检测：在254nm的紫外灯下检视3、判断：以Rf值定性。2021/3/1051（八）HPLC法：主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）

方法：对照品法要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。用“标样”的保留值定出被测组份的位置2021/3/1052三、特殊杂质检查（一）其他甾体的检查1、定义：与标示药物结构不同的甾体化合物都称为“其他甾体”2来源：原料、中间体、异构体、降解产物3、特点：（1）可能存在多个甾体杂质（2）结构类似2021/3/1053检查方法：

TLC法（高低浓度对比法）

HPLC法（类似高低浓度对比法）2021/3/1054（1）TLC法（高低浓度对比法）

判定方法：

规定杂质斑点数目

规定杂质斑点颜色2021/3/1055例：氢化可的松中其他甾体的检查供试液：本品+氯仿-甲醇（9：1）浓度：3.0mg/ml对照液：供试液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1）

60μg/ml层析：供试液点样、展开、斑点检出。

对照液判断：供试液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。2021/3/1056例：醋酸氟轻松中其他甾体的检查

取本品加氯仿-甲醇（9：1）制成3.0mg/ml作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9：1）稀释成0.06mg/ml作为对照液；照薄层色谱法，各取5μl，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇（97:3）为展开剂，展开后晾干，在105℃干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。2021/3/1057（2）HPLC法（主成分自身对照法）判定方法：

规定杂质峰数目规定杂质峰面积2021/3/1058（二）硒的检查来源合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢有毒方法药物氧瓶燃烧二氨基萘比色法测定2021/3/1059（三）游离磷酸盐的检查地塞米松磷酸钠对照品比色法供试液+钼酸铵+1-氨基-2-萘酚-4-磺酸磷钼酸蓝：740nm对照液：同上2021/3/1060RP－HPLC（大多内标法）

甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰四、含量测定测定对象：甾体激素类药物的原料和制剂。(一)、HPLC法USP、BP、JP均采用2021/3/1061示例：黄体酮的含量测定

色谱条件：固定相：ODS，流动相甲醇-水（65:35），检测波长254nm，内标物己烯雌酚系统适用性试验：N>1000，R符合规定。2021/3/1062（二）UV法△４-3-酮

240nm（±）肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素、口服避孕药苯环

280nm（±）雌激素2021/3/1063示例：醋酸地塞米松片的含量测定（1）配制供试液

（2）测定240nm的吸光度

（3）按为357计算

醋酸地塞米松的紫外吸收光谱2021/3/1064

取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于醋酸地塞米松7.5mg），置100ml量瓶中，加乙醇75ml，置50℃~60℃的水浴中保温10min，时时振摇使溶解，放冷至室温，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，置另一100ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，在240nm的波长处测定吸收度，按C24H31FO6的吸收系数为357计算，即得。具体操作及计算：2021/3/1065肾上腺皮质激素、雄性激素和蛋白同化激素、孕激素C3－酮基（1）原理异烟腙（黄）酮基异烟肼-3CHCl（缩合）1.异烟肼比色法（三）比色法2021/3/1066异烟腙（黄色）2021/3/1067（2）方法对照品法55℃异烟肼挥去乙醇对照液供试液A暗45min2021/3/1068（3）讨论A.反应专属性：具有△4–3–酮基的甾体激素在室温不到1h即可定量的与异烟肼反应，本法对△4–3–酮基具有一定的专属性。C3-酮基＞C20-酮基、C17-酮基

C11-酮基不反应B.溶剂的选择异烟肼盐酸盐→甲醇、乙醇2021/3/1069C.水分、温度、O2与光线的影响含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓溶剂不挥发、不吸收水分时→

O2与光线无影响D.酸的种类和浓度酸与异烟肼摩尔比2：1可获得最大吸收值异烟肼0.00365mol/LHCl0.0074mol/LH2SO40.0037mol/L

醋酸4.4mol/L2021/3/1070

肾上腺皮质激素类C17-α－醇酮基（1）原理2.四氮唑比色法有色甲四氮唑盐醇酮基-a-17COH-[还原]还原性2021/3/1071蓝四氮唑（BT）氯化三苯四氮唑（TTC）2021/3/1072三苯甲瓒↓深红氯化三苯四氮唑（TTC）红四氮唑（RT）2021/3/1073蓝四氮唑（BT）双甲瓒（暗蓝）2021/3/1074（2）方法：对照品法25℃氢氧化四甲基铵对照液供试液ATTC40～45′暗2021/3/1075Forexample：醋酸泼尼松龙软膏的含量测定对照液：精密称取醋酸泼尼松龙对照品20mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。供试液：精密称取本品4g（约相当于醋酸泼尼松龙20mg），置烧杯中，加无水乙醇约30ml，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸泼尼松龙溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置100ml量瓶中，同法提取三次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。2021/3/1076测定法：精密量取上述溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液2ml，摇匀，再各精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25℃暗处放置40～50分钟，照分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。2021/3/1077（3）讨论A.基团对反应速度的影响C11=O＞C11－OHC21－OH＞C21-酯B.溶剂、水分的影响

含水量大时使呈色速度减慢，当含水量不超过5%时，对结果几无影响。故以无醛乙醇为溶剂。2021/3/1078D、碱的种类及加入顺序：以氢氧化四甲基铵的结果最佳，加入顺序：碱试液四氮唑盐皮质激素溶液E.温度与时间：25℃暗处反应40-45min。C.O2与光线的影响：避光，隔绝空气or充N22021/3/1079（1）原理λmax=465λmax=515雌激素3.Kober反应比色法△△桃红黄色雌激素2OH乙醇-42SOH2021/3/1080雌二醇-3-甲醚λmax=465λmax=5152021/3/1081练习与思考[A型题]1.醋酸地塞米松的鉴别方法是A.三氯化铁反应B.水解反应C.柯柏反应D.与碱性酒石酸铜试液反应E.双缩脲反应2.丙酸睾酮《中国药典》规定的含量测定方法为A.非水溶液滴定法B.溴酸钾法C.HPLC法D.紫外分光法E.旋光法2021/3/1082112．甾体激素类药物的结构中能和四氮唑盐发生显色反应的基团

A.酚羟基

B.活泼次甲基

C.甲酮基

D.C17-α-醇酮基

E.酮基2021/3/1083

能与亚硝基铁氰化钠反应生成兰紫色的药物是

A．雌二醇

B．黄体酮

C．醋酸可的松

D．苯丙酸诺龙

E．以上都不对2021/3/1084113．异烟肼比色法测定甾体激素类药物时，药物的呈色基团是

A.酮基

B.酚羟基

C.活泼次甲基

D.炔基

E.甾体母核2021/3/1085四氮唑比色法可用于下列哪个药物的含量测定

A.可的松

B.睾丸素

C.雌二醇

D.炔雌醇

E.黄体酮2021/3/1086

用异烟肼比色法测定甾体激素药物含量时，其溶液的环境是：

A．强酸性

B．中性

C．强碱性

D．弱碱性

E．以上都不对2021/3/1087

可与重氮苯磺酸作用生成红色偶氮染料的甾体激素类药物是

A.醋酸可的松

B.睾酮

C.黄体酮

D.雌二醇

E.炔诺酮2021/3/1088

红外吸收光谱图中，羟基的伸缩振动范围约为：

A.3600-3300cm-1B.3300-3000cm-1

C.3000-2700cm-1D.2400-2100cm-1

E.1900-1650cm-12021/3/1089

红外吸收光谱图中，羰基的伸缩振动波数为

A.3600-3300cm-1

B.3300-3000cm-1

C.3000-2700cm-1

D.2400-2100cm-1

E.1900-1650cm-12021/3/1090

用四氮唑比色法测定皮质激素类药物，是利用C17–α醇酮基的何种性质

A．氧化性

B．还原性

C．可加成性

D．酸性

E．碱性2021/3/1091问题31～35A．维生素B1B．醋酸地塞米松

C．两者皆是D．两者皆不是

31.异烟肼比色法

32.硫色素反应

33.紫外分光光度法

34.羟肟酸铁反应

35.绿奎宁（Thaciaquin）反应BACDD2021/3/1092Kober反应是

A.雌性激素与硫酸乙醇共热呈色

B.皮质激素与硫酸一乙醇共热呈色

C.雌性激素与硫酸－乙醇共热呈色，用水或稀硫酸稀释后加热颜色改变

D.维生素A与无水三氯化锑的无醇氯仿溶液呈色

E.异丙嗪于酸性条件下与钯离子呈色2021/3/1093[B型题]A.亚硝基铁氰化钠反应B.Vitali反应

C.Kedde