第七章受精的机制

第七章受精的机制排卵(ovulation):

在体内外诸因素(环境,神经,激素,酶等)作用下卵子由卵巢排出。卵子的成熟和排放是互不依靠的两个过程，只有适当成熟的卵子才能受精.受精（fertilization）是两性细胞（生殖细胞）融合并创造出具备源自双亲遗传潜能的新个体的过程。受精过程完成两种不同的活动：

1.性活动（源自双亲基因的组合）

2.复制活动（新生物个体的产生）受精的两个功能：

第一个功能是将父母的基因传递给子代，

第二个功能是在卵细胞质中激发确保发育正常进行的一系列反应。

受精过程：卵母细胞成熟、精子获能、精卵间的接触和识别（包括化学趋势向性的距离效应）、精子入卵（配子融合和遗传物质的融合）、卵的激活并开始发育。受精的概念及功能第一节卵母细胞成熟绝大多数脊椎动物和文昌鱼等动物的受精发生在卵母细胞第二次减数分裂中期。

长足的卵母细胞长期停顿于第一次减数分裂的双线期。

在适当的信号刺激下可以恢复减数分裂，直至第二次减数分裂中期，成为等待受精的成熟卵母细胞。卵母细胞成熟的标记是生发泡破裂、染色体聚集、纺锤体形成和第一极体排出。

诱发卵母细胞恢复减数分裂的信号因动物而异：

海星

1-甲基腺嘌呤;

鱼类17α,20β-二轻-4-孕烯-3-酮（简写17α,20β-DHP)

两栖类

孕酮;

哺乳类

4,4-二甲基-5α-胆甾基-8,14,24-三烯-3β-酚(简称FF-MAS)。在分子水平变化为:

细胞内cAMP浓度下降,Ca2+浓度上升,蛋白质合成增加(磷蛋白pp39mos,促成熟因子MPF)

启动卵母细胞成熟分裂恢复的活动发生在细胞周期的晚G2相（或称G2/M相）。由于外源信号能迅速导致卵母细胞cAMP含量下降，推测在外源信号刺激之前，长足卵母细胞被一种依赖cAMP的PKA磷酸化的蛋白质控制着，使之停顿在第一次减数分裂的双线期。在该蛋白去磷酸化之后，卵母细胞内蛋白质合成增加。在翻译的蛋白质合成产物中，最引人注目的是pp39mos

。在长足卵母细胞质中储存着母源性c-mosmRNA，经外源信号刺激，母源性c-mosmRNA加polyA尾，由此翻译出相对分子质量39*103的磷蛋白pp39mos.该蛋白只在成熟过程中出现,受精后迅速降解。

MPF是由调节亚基CyclinB与催化亚基p34cdc2(细胞周期调控蛋白）组成，其激活不依赖于卵母细胞转录水平的活动，却依赖于翻译水平的活动。CyclinB是一种周期性合成和降解的蛋白质，对p34cdc2的去磷酸化和磷酸化具调节作用。在磷酸酯酶(cdc25基因产物）的作用下MPF前体中p34cdc2的Thr-14和Tyr-15被去磷酸化Thr-161保持原有被磷酸化的状态，成为具激酶活性的MPF。活化的MPF具自我扩增（autoamplification）作用，通过（间接）激活Cdc25进一步使更多的MPF前体活化。在一定量的MPF作用下，细胞即可跨入M相（图8.12）。随着受精，受精卵内游离Ca2+增加，钙调蛋白激活，并进一步使依赖钙调蛋白的酪蛋白激酶II（CKII）活化。随着CKII的活化c-mos基因产物pp39mos降解，Cdc2激酶失活，从而导致CSF解体，受CSF保护的CyclinB降解，细胞周期就由M相跨入G1相。

Cdk2:人​细​胞​周​期​蛋​白​依​赖​性​激​酶2​;CSF:细胞静止因子;CyclinB:细胞周期蛋白B.第二节精子获能哺乳动物新射出的精子不能受精卵子，必须经过获能（capacitation）。精子获能是指精子在若干生殖道获能因子作用下发生一系列变化获得受精能力的过程。一、获能精子中蛋白激酶活性的改变影响获能研究最透彻的激酶(获能因子)有依赖cAMP

的PKA，磷脂激活的蛋白激酶（PKC）和酪氨酸激酶。

1.PKA:在小鼠精子获能期间，腺苷酸环化酶活性和cAMP

合成均增加，PKA的两种不同成分PKI和PKA的调节亚单位可抑制获能反应。

2.PKC：PKC参与精子运动和顶体反应，用phorbolester(佛波酯)刺激PKC可加速精子获能。

3.酪氨酸激酶：用磷酸化酪氨酸抗体发现小鼠精子中3种不同是磷酸化蛋白：52kDa、75kDa和95kDa。后两种只在获能精子中磷酸化，为获能专一的标记物.

二、源于雄性生殖道的受精促进肽受精促进肽（fertilizationpromotingpeptide,FPP）在精子获能中起一定的作用。

FPP是一种由前列腺分泌到精液中的三肽(pGlu-Glu-ProNH2)。将FPP加人到未获能的小鼠或人精子悬液中，可以实现获能反应和提高受精／穿透能力。FPP尚可抑制精子顶体的丢失，使精子维持比较高的受精能力。腺苷（adenosine）能调节腺苷酸环化酶的活性，对获能和未获能的两种精子产生的作用与FPP的作用相似。两种不同受体分子的相互作用可以调节腺苷酸环化酶/CAMP的信号传递途径。体外实验已经发现若于具生物学活性的FPP连接肽，其中引人最感兴趣的是Gln-FPP(pGlu-Gln-ProNH2），存在于人类的输精管液中，它能改变FPP和腺苷的生物学活性。Gln一FPP存在于前列腺机能障碍的男人输精管内，在体内通常无明显的活性，但它能与FPP发生竞争性抑制效应。由小鼠t-complex基因编码的蛋白TCP-11，可能是FPP的受体。人类具有TCP-11的同源基因，提示TCP-11和FPP在生育／低生育力的人中占有一定作用。第三节精卵识别的分子基础精卵识别有距离识别和接触识别，前者见于体外受精动物的向化性距离识别效应；在接触识别中精子与滤泡细胞、透明带（zonepellucida，ZP）和卵黄膜在三个独立的水平精确的相互作用，其中精子与透明带相互作用为专一的反应，可诱导顶体反应(acrosomalreaction).顶体反应的重要作用在于释放顶体内的酶和使精子膜成分重新分配、暴露或被修饰。精卵不仅互相粘附，同时进行融合,并诱发卵中的一系列信号转导,导致生物学事件发生.一、

精子的向化性：许多动物卵母细胞在完成第二次减数分裂后释放物种特异的向化因子。海胆卵胶膜中分离出含14个氨基酸的精子激活肽resact，可吸引精子.二.具受体功能的精子表面蛋白：已发现动物精子在与透明带糖蛋白结合中存在一些起受体作用的精子表面蛋白。研究较多的有以下三种：1.半乳糖基转移酶(GalTase):

精子和体细胞均表达，是细胞表面的，末端具有N-乙酰葡萄糖胺的寡糖苷配体的受体。活精子表面的GalTase能选择的与ZP3(精子结合蛋白)作用，将半乳糖特异的转移到ZP3。精子表面的GalTase

与其配体结合,能激活精子的G蛋白并诱导顶体反应。2.SP56（透明带附着分子，半乳糖结合蛋白）位于顶体完整精子的头部，能与ZP3结合，可能结合ZP3上寡糖的一种外源凝集素.它是一种睾丸独有的细胞膜蛋白.3.P95能与结合ZP3结合，其特点是它的酪氨酸被磷酸化。小鼠p95与ZP3结合将激活p95中酪氨酸激酶活性启动一连串信号，导致顶体反应。精子与透明带的相互作用，诱导顶体反应，释放顶体内的酶类和使精子膜成分重新分配、暴露或被修饰。精卵不仅互相黏附，同时进行膜融合，并引发卵内一系列反应,使卵被激活.三、参与配子质膜间相互作用的一些具黏附作用的分子

Fertilin原称PH-30，为可能参与精卵膜间相互作用最有特征性的候选分子。

Fertilin为整联蛋白样蛋白，从属于ADAM‘S(adisintegrinandmetalloprotease）或者MDC’s(metalloprotease/disintegrin/cysteine-rich)分子家族。

Fertilin是通过筛选豚鼠精子表面单抗而首次分离得到的。现已发现有几种这类抗精子表面抗体可结合在参与精卵融合的精子头后部，其中一个抗体针对PH-30，具抑制精子与无ZP的豚鼠卵融合，因此PH-30被命名为Fertilin。Fertilin是一种异源二聚体蛋白，并可形成高度有序的寡聚体。1.精子膜蛋白受精素Fertilin2.Cyritestin

Cyritestin(ADAM3,tMDCI）位于顶体反应或具穿透能力的精子顶体内膜或具完整顶体的精子赤道段。Cyritestin具备ADAM/MDC家族成员特征性结构域，但在它的金属蛋白酶区无活性位点序列，表明该区已被酶解失活；同时Cyritestin在半胱氨酸富集区无融合肽序列。Cyritestin的整联蛋白配体区参与精卵之间的反应。3.卵子质膜上Fertilin的受体“Integrins”（整联素）哺乳动物卵表面的整联蛋白的亚单位有：α-2、α-3、α-4,a-5、α-6,α-m,α-v、β-1、β-2和β-3等之分。整联蛋白的抗体具阻断小鼠精卵之间的相互作用，α-2、α-4,a-5抗体在人精子与仓鼠卵间相互作用中具抑制作用。4.参与精卵间相互作用的其他分子DE(CRISP一1,ARP)一种相对分子质量37x104的精子结合糖蛋白，由附睾上皮细胞以依赖雄激素的方式合成并分泌于精子头部的表面。DE位于大鼠精子头部的背侧，在精子成熟（雌性生殖道内）的过程中，DE转移至赤道段，赋予精子与卵结合的能力。(2)细胞外基质蛋白人精子上存在几种细胞外基质蛋白，如纤连蛋白(fibronectin),层粘连蛋白(laminin)和玻连蛋白(vitronectin)。有报道纤连蛋白与精子赤道段相结合。玻连蛋白位于具完整顶体的精子顶体部，在顶体反应后释放。(3)补体成分及它们的受体精子入卵似乎涉及多种与巨噬细胞吞噬作用有关的分子，如αmβ2/C3b/CD46系统。C3由雌性生殖道分泌，被蛋白酶（如顶体素）酶解成为具活性的C3片段“C3b”，能结合于精子顶体内膜上的MCP（membranecofactorprotein,亦称CD46)；又CR3（αmβ2）能识别Cab的RGD序列区，由此推测二聚体C3b可能作为一种“桥梁”通过精子的MCP和卵的。mP2使精子与卵结合在一起。四、顶体反应的调控机制1．离子调控在离子调控中Ca2+起主导地位。在大多数哺乳动物的精子中，Ca2+主要分布于顶体区、顶体后区的顶体外膜的外表面，以及精子质膜的内表面；Ca2+的储存区是顶体反应的激烈区。现已知膜上有Ca2+泵、Na+/Ca2+交换器和钙离子通道3个Ca2+转移系统均参与调控细胞内的Ca2+浓度。Ca2十内流是早期顶体反应的关键，这在小鼠、猪、牛、豹中已获证实。Ca2+内流可导致H+外流，使精子内部pH升高，诱发顶体反应。2.脂质调控脂质在精子顶体反应调控机制中起重要作用，由它调控膜的流动性和“钙泵”的活性。牛和豚鼠精子在获能后，顶体的外膜和精子的质膜上的溶血卵磷脂含量下降，而卵磷脂含量升高。卵磷脂是由溶血卵磷脂酸产生的，并依赖于Ca2＋和磷脂酶A2作用产生溶血化合物，导致脂膜溶解，并发生胞吐作用。3.磷酸肌醇调控目前认为多磷酸肌醇的产物是诱发顶体反应的第二信使。多磷酸肌醇在磷脂酶C(PLC)的作用下，产生4,5-磷醋酞肌醇二磷酸（PIP2)。PIP2被PLC水解，产生二酰甘油（DAG）和1,4,5一三磷酸肌醇(IP3),在IP3作用下，细胞内非线粒体储存的Ca2+释放，使细胞内Ca2+的水平提高，从而激活一些顶体反应所需的关键酶；作为第二信使DAG，它活化PKC，后者使蛋白磷酸化，诱导顶体反应。五、阻止多精人卵的机制为确保胚胎正常发育，必须阻止多精受精。对于海胆阻止多精入卵的机制研究得较清楚。在精卵接触早期，当精子与卵细胞膜结合（或融合）的最初1-3s内，由于Na＋流入卵细胞膜，致使瞬时膜电压升高。这是早期阻止多精入卵迅速发生的第一个屏障。但是由于膜电压升高维持的时间非常短暂，完全阻止多精人卵还依赖于在精卵融合的瞬间发生的皮质反应（corticalreaction)或皮质颗粒反应（corticalgranulereaction)。在卵子发生中由高尔基体形成的皮层颗粒，以后迁移并分布于整个卵的皮层中。随着精子与卵细胞膜的接触和在该处Ca2+释放，皮层颗粒发生胞吐蛋白酶和透明素等物质，并且以辐射状向着卵的四周波及。其胞吐的蛋白酶裂解卵细胞膜和卵黄膜之间的连接蛋白，同时其胞吐的黏多糖形成一种渗透梯度。由于渗透压的作用，水进人细胞膜和卵黄膜之间，透明带形成。而皮层颗粒胞吐释放的其他酶使新形成的受精膜变性，出现迟缓但完全的阻止多精入卵的屏障。第四节遗传物质的融合精子与卵子的膜融合，精子的核和中心粒与线粒体和鞭毛脱离并入卵,精子核解浓缩成雄原核(malepronucleus).卵核变为单倍体即称雌原核（femalepronucleus).雄原核入卵后旋转180°,中心粒位于雌雄原核之间,两个原核彼此相向运动,融合形成二倍体的合子核。人类受精过程中雌雄原核的运动虽然哺乳动物的雌雄原核在遗传上被认为是相等的,但研究提示它们在功能上可能是不同的(右下图)。如子宫瘤(水疱状胎块)被认为是单倍体精子受精缺少雌原核的卵形成的。同样孤雌生殖或卵二倍体形成的胚胎具有脊髓、肌肉、骨骼和器官，包括跳动的心脏.但在11-12天(小鼠妊娠期的一半)停止发育.

第五节卵新陈代谢的激活成熟的卵在代谢上是一个惰性的细胞,它被精子入卵重新激活.启动一系列预定的代谢事件,如海胆:

精卵结合0秒受精卵电位升高

3秒以前精-卵膜融合30秒以前第一次钙离子增加30秒皮质泡的泡吐作用

30-60秒

NAD酶激活开始于1分钟

NADH和NADPH增加开始于1分钟精子进入1-2分钟

H+离子流出pH升高1-5分钟精子染色质解浓缩2-12分钟精子核移向卵中央2-12分钟卵核移向精子核5-10分钟激活蛋白质合成开始于5-10分钟激活氨基酸运输开始于5-10分钟起始D