地中海贫血电泳及结果分析

地中海贫血电泳及结果分析1、本实验目的：

学习与掌握DNA电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像系统判断α地贫的基因类型。2、实验原理：

电泳概念及种类影响琼脂糖电泳迁移的主要因素原理DNA分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动。电泳时DNA分子颗粒在电场中通过凝胶介质而泳动。颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。琼脂糖是从海藻中提取的、由D-和L-半乳糖残基通过α和β糖苷键交替构成的线状聚合物。琼脂糖链形成螺旋纤维，然后再聚合成半径为20-30nm的超螺旋结构。

干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，加热煮沸变为澄清，室温冷却、凝聚，即成琼脂糖凝胶。原理琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。凝胶浓度

DNA分子大小

DNA分子的构象缓冲液电泳电压主要检测：分子量，含量及有无影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移率的因素琼脂糖浓度

相同大小的线状DNA片断在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同.

琼脂糖浓度(%)分离范围（kb）

0.3

5-60

0.6

1-20

0.7

0.8-10

0.9

0.5-7

1.2

0.4-6

1.5

0.2-4

2.0

0.1-3DNA分子的大小双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与其碱基数的常用对数成反比。分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。DNA的构象DNA的构象不同构象DNA分子在电场中移动的距离不同。具有相同分子量的线状、开环状和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度不同。迁移速度：超螺旋的DNA>线状DNA>开环DNA。

电泳电压低压条件下，线状DNA在琼脂糖凝胶上泳动速度和电压成正比。随着电压升高，高分子量的DNA片段泳动速度和电压不成正比关系，分辩率下降了，因此为了得到良好的分离效果，电场电压不要超过5V/CM。

缓冲液DNA的泳动受缓冲液的组成和离子强度的影响。最常用的缓冲也是TAE(Tris-醋酸-EDTA)和TBE(Tris-硼酸-EDTA)。指示剂常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度，也可以利用其迁移率大致估计DNA的分子量，而与琼脂糖浓度无关。染色溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。EB是强致癌剂。染色吖啶橙（AO）是一种荧光色素，可与核酸亲和的荧光活体染料。荧光显微镜下核呈绿色，细胞质呈黄色。吖啶橙AO常与溴化乙啶EB合用双染.吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套)1、胶槽准备

①取出胶板和梳子，将胶板放入胶槽中;②将梳子垂直插入到胶槽的小凹槽内，梳齿底端和板面有1mm的间隙;③将胶槽放在调整好的水平台上。

2、凝胶准备

用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。①称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml1×TAE;②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖;③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB5μl(0.5mg/ml

)，并轻轻混匀。

3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶槽内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右，凝胶固化。4、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。将带凝胶的胶板置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可。5、原梳齿处(样品孔)即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。

6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。

7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。9、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳

开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：电压5v/cm；时间40-60分钟左右10、电泳结果分析：

①紫外检测仪直接观察电源条带②摄影记录

电泳结果分析电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

α地贫电泳结果分析电泳条