第1章色谱法引论

分离方法气相色谱法gaschromatography,

GC气相色谱与质谱联用GC-MS高效液相色谱

highperformanceliquidchromatography,

HPLC分离分析中的新技术毛细管电泳capillaryelectrophoresis,CE色谱法分离原理概述及分类有关的术语色谱法的基本理论分离度定性和定量分析色谱法chromatography与蒸馏，重结晶，溶剂萃取，化学沉积及电解沉积法一样，也是一种分离技术。特别适宜分离多组分的试样，是各种分离技术中效率最高和应用最广的一种方法。最早创立色谱法的是俄国植物学家茨维特Tsweet将填入玻璃柱内静止不动的一相固相或液相称为固定相自上而下运动的一相一般是气体，液体或超临界流体称为流动相装有固定相的柱子玻璃或不锈钢称为色谱柱概述及分类分离植物色素实验色谱法是一种物理、化学的分离、分析方法。利用混合物各组分在互相接触的固定相和流动相中有不同的分配比（或不同的吸附能力），当两相作相对运动时，这些组分在两相中进行多次反复分配平衡（或吸附或解吸），从而使各组分得到分离，然后按顺序被检测。色谱的分类按照分离过程中相系统的形式和特征

柱色谱法

平板色谱法填充柱色谱法毛细管色谱法

纸色谱法

薄层色谱法1依据色谱过程中流动相和固定相的物理状态气相色谱法液相色谱法超临界流体色谱法气固色谱法气液色谱法液固色谱法液液色谱法2流动相固定相按色谱动力学过程迎头色谱顶替色谱洗脱色谱

线性洗脱色谱

非线性洗脱色谱34按所利用的物理化学原理吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶渗透色谱形成络合物色谱色谱流出曲线及有关术语基线是柱中仅有流动相通过时，检测器响应信号的记录值。峰高:色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示。保留值:1死时间tM，不被固定相吸附或溶解的物质

2保留时间tR，试样从进入开始到柱后出现峰极大值3调整保留时间t'R=tR

－tM

4分配比k，也称容量因子。为组分在固定相和流动相中分配量之比,k=p/q=t'R

/tM

。（5）保留体积VR：组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所通过的载气体积（ml）。

VR=tR*FCFC为校正到柱温、柱压下，载气在柱内的平均流速死体积VM：色谱柱内除了填充固定相以外的空隙体积。

VM=tM*FC

调整保留体积VM′：扣除死体积后的保留体积。

VR′=tR′*FC=VR―VM（6）相对保留值（r2‚1）：组分２的调整保留值与组分１的调整保留值之比。

r2‚1可用来表示色谱柱即固定相的选择性，又称选择因子。r2‚1值越大，两组分的tR′相差越大，分离越好，r2‚1=1时，两组分不能分离。相对保留值的特点：r2‚1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相无关。因此，它是GC中广泛使用的定性依据。（7）区域宽度:是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，反映了色谱操作条件的动力学因素。度量法有:标准偏差；半峰宽W1/2；基线宽度Y。标准偏差：0.607倍峰高处色谱峰宽的一半；半峰宽W1/2：峰高一半处对应的峰宽度；

W1/2=2.354基线宽度W:色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距。

W=4（8）分配系数K样品组分在固定相和流动相之间发生的反复多次的吸附、脱附和溶解、挥发的过程，叫做分配过程。分配系数K：在一定温度下，组分在两相之间分配达到平衡时的浓度比，是色谱分离的依据

分配系数是由组分和两相的热力学性质决定的。在一定温度下，各物质在两相之间的分配系数是不同的。具有小的分配系数的组分，每次分配后，在气相中的浓度较大，较早地流出色谱柱；而分配系数大的组分，由于每次分配后，在气相中的浓度较小，较晚流出色谱柱。当分配次数足够多时，就能将不同的组分分离开来。相比，反映各种色谱柱柱型的特点分配比也决定于组分及固定相热力学性质，不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。对两组分的选择因子，两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。⑴分配系数是组分在两相中的浓度比，分配比则是组分在两相中分配总量之比。它们都与组分及固定相的热力学性质有关，并随柱温、柱压的变化而变化。⑵分配系数只决定于组分和两相性质，与两相体积无关。分配比不仅决定于组分和两相性质，且与相比有关。⑶对于一给定色谱体系，组分的分离最终决定于组分在两相中的相对量，而不是相对浓度，因此，分配比是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数，k值越大，保留时间越长。色谱流出曲线可以得到的重要信息根据色谱峰的个数，可以判断试样中所含组分的最少个数。根据色谱峰的保留值或位置，可以进行定性分析。根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析。色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。色谱峰两峰间的距离，是评价固定相和流动选择是否合适的依据。塔板理论塔板理论假设：⑴在每块塔板上，两相间的分配平衡是瞬间建立的，因此定义达到分配平衡的一小段柱长称为理论塔板高度H，因而理论塔板数n=L/H⑵载气进入色谱柱，不是连续的，而是脉动的，每次进气量为一个板体积△V。⑶试样开始时所有组分都加在第0号塔板上，且试样在色谱柱方向的扩散可忽略不计。⑷分配系数在各塔板上是常数，与组分的量无关。为简单起见，设色谱柱为5块塔板（n=5）组成，并以r表示塔板编号r=0、1、2、3、4，某组分在两相间的分配系数K=1，设该组分进样量为1000μɡ，根据上述假设，在色谱分离过程中该组分在各塔板上的分配如下：单一组分在色谱柱内的分配过程。若试样为多组分混合物，则经过很多次的分配平衡后，如果各组分的分配系数有差异，则在柱出口处出现最大浓度时所需的载气板体积数亦将不同。由于色谱柱的塔板数相当多，因此，分配系数有微小差别，仍可获得好的分离效果。

塔板理论导出理论塔板数的公式：峰越窄，n越多，H越小，此时柱效能越高，因而n或H可作为描述柱效能的一个指标。消除了死时间的影响

优点：（1）描述了溶质在色谱柱内的分配平衡和分离过程（2）解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，提出评价柱效的方法缺点：（1）该假设不符合柱内实际发生的分离过程（2）无法解释谱带扩宽的原因和影响板高的因素（3）不能解释不同流速具有不同的塔板高度总结速率理论吸收了塔板理论中板高的概念，并同时考虑影响板高的动力学因素，指出:填充柱的柱效受涡流扩散，分子扩散，传质阻力，流动相的流速等因素的控制，从而较好地解释了影响板高的各种因素。vanDeemter

速率理论方程指出了色谱柱填充的均匀程度，填料粒度的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度对柱效的影响。板高涡流扩散项系数分子扩散项系数传质阻力项系数流速⑴涡流扩散项（A）

A=2λdp式中dp为填充物的平均直径，λ为填充不规则因子。因此，A与流动相的性质及线速度无关。结论：①使用粒度细及颗粒均匀的填料。②均匀填充。⑵分子扩散项（B）式中Dg为组分在气相中的扩散系数，它除与组分的性质有关外，还与组分在柱中的停留时间、载气的性质、柱温等因素有关。γ指填充柱内气体扩散路径弯曲的因素（弯曲因子）。结论：①采用较高的载气流速。②控制较低的柱温。③使用相对分子量较大的载气，如因N2为分子量大，纵向扩散小⑶传质阻力相C传质阻力系数C=气相传质阻力Cg+液相传质阻力Cl结论：①采用粒度小的填充物。②采用相对分子量小的气体作载气，可减小Cg，提高柱效。结论：①降低固定相的含量，以降低液膜厚度。②采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。③控制适当的柱温。范第姆特方程式对选择色谱分离条件具有指导意义。它指出了色谱柱填充的均匀程度、填料粒度的大小、流动相的种类及流速、固定相的液膜厚度等对柱效的影响。液膜厚度（4）载气流速对板高的影响由范第姆特方程H=A+B/U+CU绘制的H——U曲线，曲线的最低点对应的塔板高度最小，该点的流速为流动相的最佳流速。

塔板高度与载气线速度的关系为了缩短分析时间，往往使流速稍高于最佳流速思考题：1、对某一组分来说，在一定的柱长下，色谱峰的宽与窄主要取决于组分在色谱柱中的（1）保留值（2）扩散速度（3）分配比（4）理论塔板数2、使用填充柱，当固定液含量较高、载气线速中等时，其塔板高度的主要控制因素是什么？3、固定相填充的均匀程度主要影响（1）涡流扩散（2）分子扩散（3）气相传质阻力（4）液相传质阻力分离度柱效和选择性理论塔板数n(n有效)是衡量柱效的指标，反映了色谱分离过程动力学性质。选择性反映色谱分离的热力学过程。常用色谱图上两峰间的距离衡量色谱柱的选择性，其距离越大说明柱子的选择性越好。柱子的选择性主要取决于组分在固定相上的热力学性质。(α)分离度也称分辨率(resolution,Rs)。既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称为总分离效能指标，用相邻两色谱峰保留值之差与两峰底宽平均值之比表示当Rs<1时，两峰总有部分重叠；当Rs=1时，两峰能明显分离；当Rs=1.5时，分离程度可达99.7%，两峰已完全分离。当然，更大的值分离效果会更好，但会延长分析时间。值越大，相邻两组份分离越好分离度受柱效n,选择因子和容量因子k的控制第一项称热力学因素，第二项称动力学因素，第三项称容量因素基本色谱分离方程式1.的大小与两组分的性质有关一般可以用如下的方法来调节:

改变流动相的组成，包括改变pH

改变固定相的组成改变柱温采用特殊的化学效应2.增加塔板数，可以增加分离度3.容量因子k取决于组分和色谱柱两者的性质

加大容量因子可以增加分离度，但是会延长分析时间，甚至造成谱带检测困难。常常通过改变柱温或流动相的组成，将k控制在15之间。影响因素例1：有一根1米长的柱子，分离组分1和2，得到色谱图。若欲得到R=1.2的分离度，有效塔板数应为多少？色谱柱要加到多长？1、用3米长的柱子分离A、B、C三个组分，A是不被保留组分，它们的保留时间分别是1.0分、16.4分、17.0分，B、C组分的峰底宽为1.0分，求该柱的分离度。2、在一根已知有8100块理论塔板的色谱柱上，异辛烷和正辛烷的调整保留时间为800s和815s，设(1+k)/k≈1，试问（1）如果一个含有上述两组分的样品通过这根柱子，所得到的分离度为多少？（2）假定调整保留时间不变，当使分离达到1.0时，所需的塔板数为多少？3、当色谱柱温为150℃时，其vanDeemter方程中的常数A=0.08cm，B=0.15cm2/s，C=0.03s，这根柱子的最佳流速为多少？所对应的最小塔板高度为多少？练习：4、在某色谱分析中得到下列数据：保留时间tR为5.0min，死时间t0为1.0min，液相体积为2.0ml，柱出口载气流速F0为50ml/min。计算：（1）死体积；

（2）保留体积（3）分配系数5、在一个3米长的色谱柱上，分离一个样品的结果如下：组分1的保留时间为14分，组分2的保留时间为17分，死时间和两组份的峰高都为1分，求（1）两组份的调整保留时间；（2）用组分2求色谱柱的有效塔板数及有效塔板高度；（3）两组分的容量因子；（4）相对保留值和分离度；（5）若使两组份的分离度为1.5，问所需要的最短柱长是多少。1、利用已知纯物质的对照法定性在一定的固定相和一定的操作条件下，任何物质都有确定的保留值。将已知纯样品与待测试样在相同条件下进行色谱分析，用TR、VR作指标（tM、VM固定不变），若二者相同可能是同一物质。保留值相同，而峰形不同，仍然不能认为是同一物质。定性和定量分析色谱定性分析峰高加入法峰高加入法是将已知纯样品加入待测组分后，再进行分析。若某组分峰比不加已知物时增高了。而半峰宽并不相应增加，则证明加入的已知物质与样品中的某一组分为同一物质。应注意，在同一根色谱柱上用保留值鉴定组分有时不一定可靠。这是因为，不同物质有可能在同一根色谱柱上具有相同的保留值，所以应采用双柱或多柱法进行定性分析，即采用采用两根或多根性质不同的色谱柱进行分离，观察未知物与标准样品的保留值是否始终重合。2、利用文献保留数据进行定性相对保留值法如果采用被测物与另一标准物质的相对保留值来定性，则某些操作条件的影响可相互消除。ris仅与柱温、固定液性质有关，与其它条件无关。具体方法：从文献上查得有关物质的相对保留值数据，注意这些数据是用什么固定液和在什么柱温下测定的，然后在相同的固定液和柱温下实验，如两者一致，一般是同一种物质。利用文献保留指数定性保留指数是指组分的保留行为，用两个紧密相连的基准物（一般是两个正构烷烃）来标定。式中：XNi、XNZ、XN(Z+1)分别为待测物、具有Z个碳原子的正构烷烃、具有（Z+1）个碳原子的正构烷烃的调整保留值。要求：XNZ<XNi<XN(Z+1)，即未知峰应在两峰之间。3、用经验规律和文献值进行定性分析碳数规律沸点规律在一定温度下，同系物的调整保留时间的对数与分子中碳原子数呈线性关系，即：如果知道某一同系物中两个或更多组分的调整保留值，则可根据上式推知同系物中其他组分的调整保留值。如果知道某一同系物中两个或更多组分的调整保留值，则可根据上式推知同系物中其他组分的调整保留值。同族具有相同碳数碳链的异构体化合物，其调整保留时间的对数与它们的沸点呈线性关系，即：4、与其它方法相结合的定性分析法与质谱、红外光谱等仪器相结合与化学方法配合进行定性分析较复杂的混合物经色谱柱分离为单组分，再利用质谱、红外光谱或核磁共振等仪器进行定性鉴定。利用化合物具有的某些官能团的特性，经过特殊试剂处理，发生物理化学或化学反应后，其色谱峰将会消失、提前或移后，比较处理前后色谱峰的差异，可初步辨认官能团的存在。气相色谱定量分析在一定操作条件下，被分析组分i的重量mi或其在载气中的浓度是与检测器的响应信号（峰高hi或峰面积Ai）成正比。色谱定量分析的基础要想正确进行分析，需要解决三个问题：准确测定峰面积或峰高；准确求出比例系数；选择合适的定量方法。1、峰面积或峰高的测量对称形峰——峰高乘半峰宽法不对称形峰——峰高乘平均峰宽法2、校正因子相对重和相对峰面积表组分真实配制（mi%）TCDFIDAi(cm2)Ai%Ai(cm2)Ai%乙醇501.5557.070苯501.23463.030？？？为了使检测器产生的响应信号能真实地反映物质的含量，就要对响应值进行校正，引入了“定量校正因子”的概念。绝对校正因子在一定操作条件下，进样量与响应信号成正比关系，即

mi=fi*Ai

或fi=mi/Ai式中fi称为绝对校正因子。fi的物理意义：产生单位峰面积所需物质的量，它主要由仪器的灵敏度及操作条件决定。当mi的单位用g/l时，fi称为绝对重量校正因子。当mi的单位用mol/l时，fi称为绝对摩尔校正因子。当mi的单位用ml/l时，fi称为绝对体积校正因子。相对校正因子fis指组分i与基准组分s的绝对校正因子之比当fi为重量校正因子时，当fi为摩尔校正因子时，当fi为体积校正因子时，无因次量，但它的数值与组分所采用的计量单位有关相对响应值检测器的响应值（灵敏度）指一定量组分mi通过检测器时所产生的信号大小。相对响应值与校正因子只与试样、基准物质以及检测器类型有关，而与操作条件如柱温、载气流速、固定液性质等无关。因而它们是一个能通用的常数。相对校正因子的测量方法：①准确称量被测组分和基准物质，混合后，在实验条件下分析，通过公式计算求得。热导池检测器用苯作基准，氢火焰离子化检测器用正庚烷作基准。②在定量分析中，也可引用文献发表的相对校正因子值，但以后的分析时，应尽可能使操作条件与文献上测定条件一致。③通过相对响应值求得。例：将纯苯与某组分A配成混合液，进行气相色谱分析，苯的样品量为0.435µg时，峰面积为4.00cm2，组分A的样品量为0.653µg时的峰面积为0.50cm2，求组分A以苯为标准时的相对校正因子。3、定量方法归一化法条件：当样品中各组分都能流出色谱柱，并在色谱图上能一一出峰，且各峰分离清晰，这样可把各组分的百分含量之和按100%计算。各组分百分含量：分析同系物时，各组分的fis相近优点：①简便、准确；②操作条件变化时，对分析结果