第九章放射性核酸探针的制备及应用

第九章放射性核酸探针的制备及应用探针（probe）是指经放射性等物质标记的特定的DNA或RNA序列。利用探针通过核酸杂交可检测特定的基因或转录产物。在基因克隆、鉴定和分析的许多方面都涉及到利用探针进行杂交，例如，鉴定cDNA和基因组DNA文库，需要用标记探针与菌落或噬菌斑杂交；分析目的基因的转录和加工情况需要用标记探针与RNA杂交，定位特定目的基因的位置，需要Southern杂交；构建限制酶图谱也可利用杂交。总之，核酸杂交的使用范围很广。因杂交是在目的DNA与放射标记探针之间进行，故在进行利用杂交的分子克隆工作中经常需要制备各种核酸探针。核酸探针根据核酸的性质可分为DNA和RNA探针；根据用放射性标记物标记与否，可分放射性核酸探针和非放射性核酸探针；根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针；根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。一、双链DNA探针

1、切口平移法(Nicktranslation)2、随机引物合成法

二、单链DNA探针

1、从M13载体衍生序列合成DNA探针2、从RNA合成单链cDNA探针三、末端标记DNA探针

1、3，末端标记2、5，末端标记

(1)前向反应(Forwardreaction)

(2)交换反应(Exchangereaction)

四、寡按苷酸探针

1、T4多核苷酸激酶标记

2、末端转移酶标记(Altar等，1989)

3、Klenow片段标记

五、RNA探针第一节放射性核酸探针的基本类型与制备方法第二节放射性核酸探针在分子生物学研究中的应用放射性核素（32P、3H、35S或125I）标记的核酸探针，已成为分子生物学研究的重要工具。它的利用，使得人们能够从分子水平上直接进行遗传物质的检测（即基因的定位、定量和顺序分析）以及重组DNA中目的片段的鉴定。这已成为同位素示踪技术的一项新的内容。放射性核素探针与分子杂交技术相结合，可以用来鉴别重组子、分离基因、分析DNA片段、研究基因表达。本节主要介绍放射性核酸探针在分子生物学研究中的应用，同时介绍有关分子杂交的部分内容。一、分子杂交的基本原理互补的核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对而形成稳定的双链分子的过程称为杂交。形成杂交分子的前提是核酸单链之间具有一定的互补序列（即有某种同源性）。分子杂交是通过印迹将核酸分子固定在固体支持物上，然后用放射性标记或非放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影显示出目的DNA或RNA分子所处位置。

二、Southern杂交MiddleSouthernblotting：1975年，E.M.Southern利用毛细作用将DNA转移到硝酸纤维纸上，…….Northernblotting：1977年，Alwine利用毛细作用将RNA转移到硝酸纤维纸上，…….Westernblotting：1979年，Towbin利用电场作用进行蛋白质转移，…….Easternblotting：1982年，Reinhart利用电聚焦作用进行蛋白质转移，…….三、放射性核酸探针在分子生物学研究中的应用（1）筛选载体外源DNA需要与某种工具重组，然后才能导入宿主细胞中进行克隆和保存或表达外源DNA中的遗传信息，这种将外源DNA携带进入宿主细胞的工具称为载体。根据核酸序列的同源性，利用放射性核酸探针与转化后宿主细胞中的质粒或噬菌体进行杂交，可以筛选出重组的质粒或噬菌体。从而实现重组载体的筛选。（2）检测基因表达细胞核内的DNA片段通过转录形成mRNA并释放到细胞质中。被检测基因在细胞中的转录情况可以进行如下分析：①Northern杂交检查细胞中是否含有特定的mRNA，测定特定mRNA在总RNA中的比例，由此获得目的mRNA的转录情况。②斑点杂交应特异性探针检测mRNA，并估计表达过程中mRNA的转录程度。（3）筛选基因文库由于在构建文库的工作中需要筛选大量的重组子，通常都采用杂交进行筛选，以便在较短的时间内获得阳性克隆。用DNA片段作为探针进行杂交的溶液主要有：甲酰胺；水溶液。这两种溶液都能得到良好的结果。（4）鉴定作物品种由于不同品种的作物，其DNA和mRNA存在着差异，因此用特定的核酸探针进行不同品种间的分子杂交，可得到不同品种在遗传物质上的差异。（5）诊断与鉴定病害在病害的诊断和鉴定中，核酸探针技术被认为是一种非常有力的手段。它不仅能确定染色体组的组成和基因的功能，而且为病毒的诊