植物遗传转化

植物遗传转化的策略与方法杨清植物转基因研究概况遗传转化的策略遗传转化的主要方法植物转基因现状1983年比利时根特大学Montagu实验室、孟山都公司Fraley领导的研究小组、华盛顿大学Chilton的研究室首次将外源基因转入烟草、胡萝卜。到1993年，世界上转基因成功的植物就已突破60种，至今已有35科120多种植物转基因获得成功。从1986年首批转基因植物被批准进入田间试验，至今国际上已有30个国家批准数千例转基因植物进入田间试验，涉及的植物种类有40多种。主要包括延熟番茄,抗除草剂的玉米、棉花、大豆和油菜,抗虫的马铃薯、棉花和玉米,抗病毒的西葫芦、南瓜和番木瓜,雄性不育的玉米和莴苣,以及改变油脂特性的油菜和大豆等。1987年我国首次获得转Ｂt基因的烟草和番茄以来，相继获得了转Ｂt基因的棉花、水稻、玉米等。我国目前正在研究的转基因植物有47个种，涉及的各类基因103个。遗传转化的策略按目的基因数量单基因转化双基因转化多基因转化(同源重组构建多基因双元载体)Multiple-roundinvivosite-specificassemblyMultiRoundGateway多聚蛋白酶解法依赖归巢酶的pRCS/pAUX和

pSAT载体系统Cre/loxP位点特异重组系统MultiSiteGateway(常规的)酶连重组法BiBAC/TAC大分子量DNA转化法多基因转化方法连续再转化法转基因植物杂交聚合法多载体共转化法多基因载体转化法

多重同源重组法:一种基于同源重组构建多基因双元载体的方法(张兴国)按目的基因导入位置细胞核叶绿体按启动子的类型组成型启动子特异性启动子遗传转化的主要方法农杆菌介导的遗传转化基因枪法电击法注射法化学药剂诱导转化花粉管通道法根癌农杆菌Ti质粒转化系统外植体+农杆菌共培养芽诱导抗生素筛选生根培养,植株再生分子检测,转基因植株获得技术特点：转化拷贝数低携带目的基因片段大整合后外源基因结构变异小操作简便等优点该技术已成为转化成功最多的一种转化方法基因枪法(particlegun)又称微弹轰击法(microprojectilebombardment或particlebombardment)。该法借助高速运动的金属粒子将附着于其表面的核酸分子引入受体细胞，外源基因进入受体细胞核后整合到染色体组，然后通过组织培养再生出完整个体(植株)。优点：受体材料来源广泛靶受体类型广泛缩短了转基因周期、转基因植株变异率低及通常具有正常的育性缺点：转化效率不高多拷贝插入费用较高电击法又称电穿孔法(electroporation)。在高压电脉冲作用下，使新鲜分离的原生质体质膜形成可逆性瞬间通道，外源DNA穿过通道进入细胞，并整合到染色体组。

优点：不受宿主限制操作简便对植物细胞不产生毒性转化效率较高，特别适于瞬间表达缺点：易造成原生质体的损伤存在原生质体再生困难注射法开始用于动物卵细胞，后来被用于植物。用显微注射仪把外源DNA溶液注入到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生高的压力及卵细胞的吸收，使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植株。对于子房大、多胚珠的作物，可以说是一种简便可行的转化途径。化学药剂诱导转化

常用的化学诱导剂：聚乙二醇(PEG)多聚鸟氨酸(PLO)聚乙烯醇(PVA)PEG是一种细胞融合剂。PEG法是最常用的化学基因转化方法,它是将Ti质粒与原生质体共同培养在含有PEG和Ca2+的溶液中，在高pH值条件下,原生质体摄取外源DNA分子,然后经再生获得转基因植株。优点：不受宿主范围的限制操作简便成本底缺点：一般只适用于原生质体的转化，而原生质体再生植株并不容易，转化效率低;再生植株常不可育或形态异常、多拷贝插入等现象。花粉管通道法利用开花植物授粉后形成的花粉管通道，直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，实现目的基因的转化。步骤：１）去除花冠;２）用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度的约１／４处，再退回２毫米左右;３）注入含外源目的基因的缓冲液;４）正常管理，收获种子,经筛选获得转基因植株。技术特点：直接、简便易行;不需要组织培养的继代，从而排除了植株再生的障碍；但转化效率较低；适合于花器官较大的植物。小结

虽然有不同转基因方法，但使用最为广泛的方法仍是农杆菌法和基因枪法两种方法。转化方法的选择，取决于植物种类和实验室自身具备的条件。遗传转化实例类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶

3GT基因马铃薯块茎中的特异表达受体材料:

马铃薯品种Desiree目标基因