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文档简介
细胞生物学实验
——步骤集PEG促细胞融合法的步骤(1)取鸡血2ml+2mlAlsever液,再加入6mlAlsever液,混匀后制悬液。(可在4℃保存)(2)取(1)1ml+4ml0.85%的NaCl溶液,进行以下三次离心处理:①.1200r/min离心5分钟。(去上清液,再加入至5ml的0.85%NaCl液)②.1000~1200r/min离心5分钟。(去上清液,再加入至5ml的0.85%NaCl液)③.1000~1200r/min离心7分钟。(3)将上步最后一次的沉降血球(去上清液后,约0.1~0.2ml),加入GKN液至1~2ml,使之成10%的细胞悬液。(4)取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液,使每毫升含血球15000000个,即。(5)取(4)1ml+0.5ml50%的PEG液,或取(4)0.5ml+0.5ml50%的PEG液,或取(4)0.5ml+1.0ml50%的PEG液,混匀滴片,在常温下2~3分钟后,镜下观察。【细胞凝集反应实验步骤】1.取土豆去皮块茎2克,加10mlPBS缓冲液,浸泡24小时,浸出的粗体液中即含有可溶性土豆凝集素。2.抽取兔子静脉血(加抗凝剂)1ml,加生理盐水3ml,在1000r/min条件下,离心5分钟。重复三次离心,最后按压积红细胞体积用生理盐水配成1%的红细胞悬液。3.分别用滴管吸取土豆凝集素和1%的红细胞悬液各一滴,置双凹片的左孔内,充分混匀。4.同时分别用滴管吸取PBS缓冲液和1%的红细胞悬液各一滴,置双凹片右孔内,充分混匀,作对照实验。5.摇晃5-10分钟后,观察有无发生细胞凝集并置显微镜下观察。
实验步骤—苏丹Ⅲ染色法断头法处死小鼠,置于解剖盘中,剪开腹腔,用镊提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜,并在其下部置一载玻片,用剪连同盖玻片和其上粘的肠系膜取下,滴加甲醛钙于有标本的载玻片处,使标本润湿,固定20分钟。吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗,用滴管不断吸去液体以去除固定液。用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作,再进行一次冲洗。用苏丹Ⅲ染色30分钟。吸去溢出染液,擦净盖玻片表面及周边,显微镜观察。
原代细胞(脾细胞)培养步骤1.取材:取小白鼠一只,采用断头法处死;清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟。取出转入超净洁净台内的解剖盘内,无菌操作打开腹腔。取出脾脏,去除其周围的脂肪组织,镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。转入无菌玻璃培养皿中,待用。2.分离脾细胞:用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴,再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml,然后将其沿脾长轴方向注射入脾内(使脾脏膨胀以利于细胞散开)。用针尖在脾脏上扎眼,并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞,用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞,稍倾斜并静置1~2分钟。吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管,并使量至1ml,以3000转/分离心1~2分钟。3.培养脾细胞:超净洁净台中取塑料培养皿一个,用“枪(1ml)”加入细胞培养液2ml,并在皿盖上画上标记,待用。取上述离心后的Eppendorf管,在超净洁净台内开盖弃去上清液,用“枪(200μl)”吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中,用枪头吹匀管底的脾细胞,然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中,混匀,然后放入37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞生死状态的鉴别——台盼蓝(TrypanBlue)法(1)试剂配制:用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液,备用。(2)细胞悬液制备:将生长有贴壁型细胞的培养瓶(皿)中的培养液倒入干净试管中,向培养瓶(皿)中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液l~2ml,静置3~5min,待见到细胞变圆,彼此不连接为止,弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中,用滴管轻轻吹打细胞,制成细胞悬液。(3)染色制片:取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中,加1-2滴(约0.1ml)染液,混合,2min后制成临时装片,镜检。(4)染色结果:死细胞染成蓝色,活细胞不着色。或者, (3)染色计数:取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中,加1-2滴(约0.1ml)染液,混合2~5min,滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上,使悬液自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生,否则要重新滴加。在普通光镜10X物镜下计数四个大格内的细胞数,压线者数上不数下,数左不数右。(4)根据染色结果计算活细胞率:依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数,以如下公式计算细胞存活率:
II.伊红Y(EosinY)法(1)试剂配制:用生理盐水配制0.15%伊红染液,备用。(2)细胞悬液制备:将生长有悬浮型细胞的培养瓶(皿)稍微倾斜,用滴管轻轻吹打细胞,制成细胞悬液。(3)染色制片:取上述细胞悬液少许,然后加入其等体积量的0.15%伊红染液,混合,2min后制成临时装片,镜检或计数。(4)染色结果:死细胞染成桃红色,活细胞不着色。III.美蓝(MethvleneBlue)染色法(1)试剂配制:用蒸馏水配制0.1%美蓝染液,备用。(2)染色制片:在干净的载玻片中央加一小滴0.1%美蓝染色液,然后再加一小滴酵母菌悬液,混合均匀,染色3~5分钟后从液滴侧面盖上盖玻片并吸去溢出的液体,制成水浸标本片,镜检或计数。(3)染色结果:死酵母菌细胞染成蓝色或淡蓝色,活酵母菌细胞不着色。细胞生死状态的鉴别
a.平面图(中间平台分为两半,各刻有一个方格网)b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙)
使用血球计数板直接计数时,先要测定每个小方格(或中方格)中的细胞数量,再换算成每毫升液体中细胞的数量。每毫升液体中细胞的数===每个大方格中的细胞数量╳10000╳稀释倍数叶绿体分离的步骤1.选取新鲜嫩滤菠菜叶,去叶梗及粗脉,洗净擦干,称30克放于150ml0.35M.Nacl溶液中;2.将叶、液同装入组织捣碎机中,匀浆3–5分钟,转速5000r/min;3.将匀浆用纱布(6层)过滤于500ml烧杯中;4.取滤液4ml在1000r/min下离心2min;5.取上层清液在3000r/min下离心5(沉淀为叶绿体和细胞核混合物);6.将沉淀用2-3ml0.35Mnacl液悬浮;7.取一滴悬液滴片,加盖片后显微镜下观察;8.另取一滴悬液滴片,再滴加一滴0.01%的吖啶橙染料,混匀,盖上盖片,在荧光显微镜下观察。
小白鼠肝细胞线粒体超活染色的步骤
1、用断头法处死小白鼠,置于解剖盘中,剪开腹腔,取小白鼠肝组织,选取边缘较薄的肝组织0.5cm3,放入小烧杯中,用Ringer液冲洗去血污。
2、在干净的凹面载玻片的凹穴中,滴加1/5000詹纳斯绿B溶液,再将肝组织块移入染液中,注意不可将组织块完全淹没,要使组织块上面部分半露在染液外,这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化,易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(—般需染20~30min)。
3、吸去染液,用眼科剪将组织块着色部分剪下重置小烧杯中,滴加
Ringer溶液0.5ml,用剪刀充分剪碎制悬液。
4、取上述细胞悬液滴片,加盖玻片,高倍镜下观察。结果:肝细胞质中的线粒体被染成蓝绿色(黄绿色)。小白鼠染色体标本制作步骤
取雄性小鼠以每克体重4μg注射秋水仙素,经14~16小时后,断头法杀死小鼠,取出睾丸用生理盐水(0.9%的NaCl)洗去血污。放入装有1ml0.3%KCl液的小烧杯中剪碎至呈乳白色。用铜网过滤到刻度离心管中,再加0.3%KCl液至4ml。37℃静置30分钟,进行低渗处理。以800~1000转/分离心8分钟。弃上清液,加入2ml甲醇·冰醋酸固定液(3:1),并用吸管至管底吹气,轻轻打散细胞,固定8分钟。再以800~1000转/分离心8分钟。弃上清液,加1ml固定液,再制成细胞悬液,固定5分钟。取洁净的低温预冷载片,距载片10~15cm高度滴下2~3滴细胞悬液,从载片一边向另一边轻轻吹气,并同时轻轻敲打载片,以使细胞均匀分布和促使染色体展开。用滤纸擦去载片上多余液体,空气干燥或成文火干燥。染色体标本染色与观察用Giemsa染色20~30分钟,细水冲洗玻片背面,去多余染液,气干。镜检:低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相,高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数。人外周血染色体标本制备
(一)细胞培养
1.培养基的配制:
在超净工作台中,100ml培养基含以下成分和比例:
RPMI-1640
84ml
小牛血清
15ml
PHA
3支
肝素钠
1ml
卡那霉素
终浓度为100单位/ml
以5%NaHCO3(无菌)或1NHCl调pH至7.2-7.4。
用刻度吸管将培养液分装入培养瓶(10ml/瓶),4℃备用。
2.采血:酒精消毒皮肤,肘静脉采血0.3-0.5ml,立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞,向10ml培养基中注入30-40滴全血,轻摇匀后置37℃恒温箱培养。
3.培养:时间为68小时。培养期间,定期轻摇匀,使细胞充分接触培养基。
4.秋水仙素处理:终止培养前2-4小时,在培养液中加入秋水仙碱(用1ml注射器5号针尖滴加2滴,使终浓度为0.07μg/ml)。
以上步骤均需无菌操作。
(二)染色体制备
1.收集细胞:将培养物全部转入洁净离心管中,以1000rpm离心8-10分钟,弃上清液。
2.低渗处理:向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml,用滴管混匀,置37℃恒温水浴中低渗15-25分钟。
3.预固定:低渗后加入0.5mlCarnoy’s固定液,轻轻混匀后1000rpm离心8-10分钟。
4.一固定:弃上清液,加入5ml固定液,轻轻混匀,静置20分钟。1000rpm离心,弃上清液。
5.二固定、三固定:同一固定。
6.制悬液:弃上清液后,视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。
7.滴片:吸取细胞悬液自10-20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上,轻吹散,气干。
8.染色:1:10Giemsa染色5-10分钟,细水洗去多余染液,气干。
9.镜检:低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相,油镜下观察染色体形态并计数。
染色体组型实验的步骤1.选择染色体清晰的照相底片,用放大机制作出放大10倍的清晰照片。2.将染色体逐一剪下,并对每个中期染色体逐一进行测量,包括每条染色体的长度和每个臂的长度。3.根据测量数据,计算出每对染色体平均的相对长度、臂指数与着丝粒指数。4.把相对长度与臂指数相近者配成一对。5.参照相对长度、臂指数与着丝粒指数的数值,并根据标准顺序,编排出染色体组型图。6.用胶水或浆糊将每条染色体依照标准顺序粘贴在实验报告纸上。人类体细胞染色体的分类标准及其主要特征
小鼠的转基因技术录像Procedure1.Dissectionofoviducts.Recoveryoffertilizedeggs.Removalofcumuluscells.Procedure2.Recoveryof8-cellembryos.Removalofthezonapellucida.Constructionofaggregationchimeras.Procedure3.Dissectionofuteri.Recoveryofblastocycsts.Procedure4.DNAinjectionintopronucleitoproducetransgenicembryos.Procedure5.Nucleartransfer.Procedure6.Blastocystinjectionofembryonicstemcells.Procedure7.Vasectomizingmalemice.Procedure8.Oviducttransferofmanipulatedembryos.Procedure9.Vterinetransferofmanipulatedembryos.Procerdure10.Recoveryof6.5and7.5dayembryos.P
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