发酵工业菌种

第2章发酵工业菌种在发酵工业中，工业生产水平主要由三个要素决定，即：

1、生产菌种性能

2、发酵及提取工艺条件

3、生产设备

其中，生产菌种是最重要的因素，是发酵的灵魂。2.1发酵工业常用菌种2.1.1发酵工业对菌种的要求（1）菌种不能是病源菌（2）发酵周期短，生产能力强（3）发酵过程中不产或少产与目标产物性质相似的副产物（4）原料来源广价格低廉，菌种能高效地将原料转化成产品（5）对需添加的前体有耐受能力，且不能将前体作为一般碳源利用菌种纯，遗传性能稳定，不易变异退化可以在易于控制的条件下发酵2.1.2发酵工业常用菌种（1）细菌自然界分布最广、数量最多的一类微生物，单细胞原核生物。

①工业常用的有枯草杆菌、短杆菌②还常用作基因工程载体的宿主细胞，用于构建基因工程菌来生产外源物质。（2）酵母菌单细胞真核生物，主要分布于含糖较多的酸性环境中如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上，以及果园土壤中。常用的有啤酒酵母、酒精酵母。酿酒酵母假丝酵母红酵母（3）霉菌是一群在营养基质上形成绒毛状、网状、絮状菌丝真菌的通称。分布于偏酸性环境中，常用的有根霉、毛霉、青霉等根霉曲霉青霉（4）放线菌因其菌落呈放射状而得名。属原核微生物类群。分布于有机质丰富的微碱性环境中，大多腐生，少数寄生

。最大价值在于能生产多种抗生素，从微生物中发现的抗生素有60%以上的是来自于放线菌。常用的有链霉菌属、小单孢属等。（5）其它类①药用真菌：如灵芝、茯苓、冬虫夏草等②藻类：如螺旋藻2.2发酵工业菌种的分离筛选符合发酵工业要求的菌种可从如下途径获得：

1从自然界分离筛选

2从菌种保存机构直接购买所需的菌株

3从生产过程中发酵水平高的批号中重新进行分筛获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工业生产的第一环节。菌种分离：将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需的微生物的过程。

从自然界分离筛选菌种的一般步骤：样品采集样品预处理富集培养菌种分离初筛、复筛

性能鉴定

2.2.1样品采集总原则是：（1）

样品来源越广，获得新菌种的可能性越大；（2）要了解目标产物的性质和可能产目标产物的微生物种类及其生理特征。

①了解微生物的代谢规律。如初级代谢基本相同，但通常丝状菌及产芽孢细菌才能进行次级代谢。②考虑微生物的生理特征。如营养类型、生长环境等。1土样选择如酵母菌果园产蛋白酶菌鱼、肉加工厂高温酶产生菌火山或温泉

耐压菌油井或海洋深处采样深度

离地表5-25cm处较好。季节条件

避免雨季，一般以秋季最理想。采样方法

用无菌器具按规范取样，记录采样地点、时间、环境情况等以备考证。2.2.2样品的预处理

预处理可提高菌种的分离效率，常使用的方法有：（1）物理方法：

热处理：常用来减少样品中的细菌数。

膜过滤和离心法：用来浓缩水中的微生物细胞。（2）化学方法：在培养基中添加某些化学成分来增加特定微生物数量。①②（3）诱饵法：

将一些固体物质加到待分离的土壤或水中做成诱饵富集目的菌。2.2.3富集培养

利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的要求不同，投其所好取其所抗，使目的菌成为人工环境下的优势菌。（1）控制培养基的营养成分：如唯一碳源（2）控制培养条件：如T、DO、pH、添加抑制剂等2.2.4菌种分离

常用的纯培养分离方法有：（1）平板划线法（2）稀释分离法（3）简单平板分离法（4）涂布分离法（5）毛细管分离法（6）小滴分离法通常某些菌种在分离时就可进行筛选，一般这些菌在平板上培养时，其产物可与指示剂、显色剂或底物等反应而直接定性地鉴定。

常用的平板快速检测法有：（1）透明圈法

分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈与菌落直径比的大小初步反应菌株利用底物的能力。土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后制备成菌悬液涂布在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法初筛在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。但作为初筛的手段是有意义的对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来。（2）变色圈法用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。如筛选果胶酶产生菌甘油三丁酸酯为底物罗丹明B为指示剂荧光圈又如分离解脂微生物豆油作底物中性红（红～黄.6.8～8.0.）指示菌落周围呈红色圈（3）生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌指示菌（工具菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌（4）抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈指示菌采用抗生素的敏感菌2.2.5菌种的初筛和复筛

目的是选择产物合成能力较高的菌株。并不是所有菌种都能利用平板快速检测法鉴定，因此就要使用常规的生产性能鉴定，即初筛和复筛。

（1）初筛：以量多为原则（2）复筛：结合生产工艺条件2.3性能鉴定

（1）确定菌种类型（2）测定一系列生产指标，包括菌种毒性试验和生产性能鉴定。

常用的鉴定菌种的方法有：（1）经典的分类鉴定法（细胞的形态和习性）（2）现代分类鉴定法（遗传型的鉴定、细胞化学成分等）（3）将菌种送到权威机构鉴定2.4发酵工业菌种改良

2.4.1

菌种改良目的

1提高产物产量

2提高产物纯度，减少副产物

3改良菌种性能，改善发酵过程

4改变生物合成途径，获得高新产品2.4.2菌种改良的方法1自然选育

在生产过程中，不经过人工处理，利用微生物的自然突变而进行菌种筛选的过程。

引起自然突变的因素：（1）多因素低剂量的诱变效应（2）互变异构效应2、诱变育种

人工采用物理、化学和生物的方法促使微生物发生突变的育种手段。（1）选择出发菌株：原则是要对诱变剂的敏感性强，变异幅度大，产量高（2）同步培养：使生理状态一致（3）制备单细胞或单孢子菌悬液：能均匀接触诱变剂（4）诱变处理：诱变剂种类、剂量大小、处理时间（5）筛选变异菌株：①平板快速检测法②形态变异的利用③高通量筛选3、杂交育种

微生物杂交的本质是基因重组。4、原生质体融合

原生质体融合和杂交育种都是在细胞水平上的操作。原生质体融合可以在种间、种内、属间发生。5、基因工程育种2.5发酵工业菌种保藏2.5.1菌种变异及退化机理一、菌种退化指生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌种，由于进行接种传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。1、退化表现：2、退化原因：

从量变到质变的逐步演变过程。（1）基因突变：根本原因（2）连续传代：直接原因3、防止菌种退化的措施（1）减少传代次数（2）选择合适的培养条件（3）利用不易衰退的细胞传代（4）采用有效的菌种保藏方法二、退化菌种的复壮1、纯种分离法2、淘汰退化的个体2.5.2菌种保藏技术一、菌种保藏原理

采用低温、干燥、缺氧、缺营养等手段使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。二、常用的菌种保藏方法1、斜面低温保藏法（定期移植保藏法）①方法：②原理：低温③适用范围：各类微生物④保存期限：不产芽孢的细菌每月需移植一次产芽孢的细菌3个月移植一次

酵母、霉菌、放线菌3—6个月移植一次⑤优点：方法简便，便于操作⑥缺点：保存时间短，变异退化几率大2、液体石蜡覆盖保藏法①方法：②原理：低温、缺氧③适用范围：酵母、霉菌、放线菌和好气性细菌④保存期限：不同种类M保藏期限不同，一般为

1—10年⑤优点：方法简单，不需特殊设备，保藏期限相对较长⑥缺点：对厌氧菌及可分解利用烃类的M保藏效果较差3、砂土管保藏法①方法：制备砂土管制备斜面培养物制备菌悬液干燥保藏②原理：低温、缺氧、干燥、缺营养③适用范围：耐干燥的菌种，如细菌芽孢、放线菌及真菌孢子④保存期限：几年—几十年⑤优点：简单易行，保藏时间长⑥缺点：工作量大，费人力，对干燥敏感的

M不适用4、冷冻干燥保藏法①方法：选择和制备保护剂准备菌种和菌液

预冻冷冻干燥

保藏②原理：低温、缺氧、干燥③适用范围：除某些不产孢子的丝状真菌，其他各类M均可采用④保存期限：一般可达10年以上⑤优点：保存期长、变异小、适用范围广、存活率高，大多数专业保藏机构采用⑥缺点：需要专业设备，操作过程相对复杂5、液氮超低温保藏法①方法：准备安瓿管制备菌悬液分装和熔封安瓿管冷冻保藏复活②原理：超低温，M的