第3章 细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法

细胞形态结构的观察方法

细胞组分的分析方法

细胞培养、细胞工程与显微操作技术1第一节细胞形态结构的观察方法

光学显微镜技术（lightmicroscopy）

电子显微镜技术

(Electromicroscopy)

扫描遂道显微镜

(scanningtunnelingmicroscope)

2一、光学显微镜技术（lightmicroscopy

普通复式光学显微镜技术

荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦扫描显微镜技术（LaserConfocalMicroscopy）

相差显微镜（phase-contrastmicroscope）微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）3普通复式光学显微镜技术分辨率（即分辨极限,D）是指区分开两个质点间的最小距离.习惯说的分辨率高则是指该分辨极限小；人眼的分辨率：100m，光学显微镜的最大分别率：0.2m.放大倍数:光学显微镜在用空气作介质时,最大放大倍数为1000倍,用油镜时为1400倍.45荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）原理与应用

直接荧光标记技术

间接荧光标记技术（荧光免疫）

在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：

如绿色荧光蛋白(GFP)的应用

6789激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)激光共聚焦扫描显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，能显示细胞样品的立体结构。图1图210laserconfocalscanningmicroscope,LCSM11LCSMImageofaXenopus

Melanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)http:///12用激光共聚焦显微镜看到的各种细胞13暗视野显微镜

darkfieldmicroscope聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野背景是黑的，物体边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。1415把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处:环形光阑：位于光源与聚光器之间。相位板：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。相差显微镜（phasecontrastmicroscope）由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。图相差显微镜16用途：观察未经染色的玻片标本17不同显微镜下细胞18二、电子显微镜技术

电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造

主要电镜制样技术超薄切片技术负染色技术冰冻蚀刻技术电镜三维重构技术

扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）1932年德国学者MaxKnolls和ErnstRuska用波长比光短得多的电子作光源,发明了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开拓了超微世界。19电子显微镜与光学显微镜的基本区别

分辨本领

光

源

透

镜

真

空

成像原理

人眼

100m

可见光

光学显微镜

0.2m

可见光

(波长400～700nm)

利用样本对光的吸收形成明暗反差和颜色变化

0.1m

紫外光

玻璃透镜

不要求真空

电子显微镜

接近0.1nm

电子束

(波长0.01～0.9nm)电磁透镜

1.33×10-5～1.33×10-3Pa

利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差

20电镜与光镜光路图比较光源聚光镜样品物镜目镜直接成像电源聚光镜样品物镜目镜荧光屏上观察图象电源透镜透镜样品荧光屏上观察图象射线扫描器光学显微镜透射电镜扫描电镜21电子显微镜的基本构造22透射电子显微镜TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM23主要电镜制样技术超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图

负染色技术（Negativestaining）图

染色背景，衬托出样品的精细结构 冰冻蚀刻技术（Freezeetching）技术示意图 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面 的蛋白质颗粒和膜表面结构。电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合 而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技 术相结合，是当前结构生物学——主要研究生物大分子空间结 构及其相互关系的主要实验手段。24电镜样品的制备25负染色技术用重金属盐(如磷钨酸)染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria

2627扫描电镜（SEM）原理与应用：

扫描电子显微镜于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题。图1图2图3图42829Scanningelectronmicroscope（SEM）30人类血细胞SEM照片图片来自http:///31酵母32人类精子33三、扫描隧道显微镜原理：量子力学中的隧道效应特点：（1）分辨本领高，（侧分辨率为0.1～0.2nm，

纵分辨率可达0.001nm）； （2）可在真空、大气、液体等多种条件下工作； （3）非破坏性测量样品的完整外貌。用途：纳米生物学研究领域中的重要工具34STMimageofaDNAmolecule35第二节细胞组分的分析方法

离心分离技术

细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法

特异蛋白抗原的定位与定性

细胞内特异核酸的定位与定性

放射自显影技术

定量细胞化学分析技术36一、离心分离技术

用途：

离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体等细胞器，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10000-25000r/min的离心机称为高速离心机；转速超过25000r/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达80000r/min，离心力超过500Kg。

差速离心密度梯度离心

37（一）、差速离心在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。38（二）、密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。39速度沉降主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。等密度沉降适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。40二、细胞内核酸、蛋白质、

酶、糖与脂类等的显示方法

原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。411.Schiff反应：分子中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为紫红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）.DNA的福尔根反应2.脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。3.茚三酮反应：显示蛋白质。4.金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。4243三、特异蛋白抗原的定位与定性免疫荧光技术：根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，并标上标记荧光素，对抗原进行定位测定的技术。快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。蛋白电泳(SDS）与免疫印迹反应(Western-Blot)免疫电镜技术：能有效提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术

应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等44四、细胞内特异核酸的定位与定性光镜水平的原位杂交技术:同位素标记或荧光素标记的探针电镜水平的原位杂交技术:生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合PCR技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）在体外将目标DNA大量扩增,以便分析.

45人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片46六．定量细胞化学分析技术

流式细胞仪（FlowCytometry）主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。

47其主要工作原理是：经荧光染色的单细胞悬液被高压压入流动室内，在PBS或生理盐水等壳液(SheathFluid)的包裹和推动下形成单细胞状态，并以每分钟5000—10000个细胞的高速度从流动室内喷出。在与细胞束呈90°角的方向，受到来自氩离子激光器的激光束照射而激发荧光。通过各种物镜及滤光片将从不同角度收集的荧光投射到光电倍管并转换为各种强弱不等的电脉冲信号显示出来。这些信号输到电子计算机中贮存，经处理和分析便可得到多种信息参数。进行细胞分类时，根据需要对含细胞的水滴选择性充电，在带有高电压的偏转板作用下，带正电荷的水滴落入左方收集管内，带负电荷的水滴落入右方收集管内，不带电荷的水滴进入中间的收集管。分类主要根据细胞的荧光强度，即单细胞DNA含量。图48流式细胞术

流式细胞术49细胞显微分光光度术

原理：细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为260nm，而蛋白质的则为280nm。有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。

应用：根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。

50第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术

细胞的培养

细胞工程51一、细胞的培养

动物细胞培养

类型：原代培养细胞

继代培养细胞

细胞株

细胞系

植物细胞

类型： 原生质体培养（体细胞培养）

单倍体细胞培养（花药培养）非细胞体系52原代培养（primaryculture）：也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（subculture）的细胞，便不再称为原代培养，而改称为细胞系。传代（passage）：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增3-6次。53细胞系（cellline）：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（finitecellline）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（infinitecellline）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性。细胞株（cellstrain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（substrain）。54Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养55

二、细胞工程细胞融合与细胞杂交技术图单克隆抗体（monocloneantibody）技术图细胞拆合与显微操作技术物理法结合显微操作技术