第二章 病原致病基因

第二章

病原物致病基因的类型

1决定亲和性的基因

1.1编码致病因子的基因：胞壁水解酶酶基因、毒素基因、植物生长调节物质合成有关酶的基因、编码未知产物的基因。病原菌中还有正向调控寄主范围的基因，将这些基因转移到相关细菌中，可使受体菌扩大寄主范围，使原来的不亲和互作变为亲和互作，这在植物病原细菌的小种和致病变种中都有发现。

1.2克服寄主防卫反应的基因：目前已报道的有植物病原真菌对植保素解毒酶基因（pda）。

2决定不亲和性的基因2.1无毒基因（avr）

无毒基因编码特异性激发子与抗病基因产物受体互作。病原无毒基因编码的产物是蛋白质，这些蛋白质有些是直接起激发子的作用，如番茄叶霉病菌的无毒基因avr9编码63个AA的多肽。而有些是编码激发子合成的酶，如番茄丁香假单胞菌的无毒基因avrD的产物是3.4×104u的蛋白，在合成激发子中具有酶的功能。

TMV的外壳蛋白在含有N’抗病基因的烟草中是过敏反应的激发子；其avr表型决定因子可能是复制酶蛋白，有些植物病毒的运动蛋白基因也具有无毒基因的功能（Padgettetal，1993）。2.2决定非寄主不亲和性基因（寄主专化性基因）

目前，在植物病原细菌和真菌中都已分离到非寄主专化性的激发子。韦忠民（1993）证明梨火疫病菌hrpN的编码蛋白（harpin）具有激发子功能，能诱导非寄主植物产生过敏反应。第一节植物病毒的侵染过程

及其与致病相关基因1.植物病毒基因组特征以核酸为核心，外被外壳蛋白亚基形成的外壳,多不具包膜。外壳蛋白多为一种，偶尔两种。如果外面具有包膜，则结构蛋白往往比较复杂，如植物弹状病毒有五种结构蛋白；植物呼肠病毒含7种结构蛋白。植物病毒核酸绝大多数为（+）ssRNA，少数为（-）ssRNA

、dsDNA（double-stranded）、ssDNA、dsRNA。（1）（+）ssRNA的植物病毒基因组主要包括4种类型：单分体基因组整套基因的遗传信息储藏在一条核酸分子中。例如TMV、PXV、PYV、TYMV、SBMV(南方菜豆花叶）等。两分体基因组基因组分布在两条核酸上，并被分别包装在两个颗粒中。如烟草环斑病毒(TRSV)、石竹环斑病毒(CRSV)和豇豆花叶病毒(CPMV)。三分体基因组整套基因组分布在3-4条核酸中，并分装于三个病毒颗粒中。如CMV、AMV(苜蓿）、BMV（雀麦）和BSMV（大麦条纹），均有4条，其中RNA1包装在一个颗粒中，RNA2包装在另一颗粒中，RNA3+RNA4包装于第三颗粒中。多组分病毒如绒烟斑驳病毒，离体内含线状和环状两种ssRNA，侵染性要求两种同时存在。(2)ssDNA植物病毒最主要的为双生病毒(Geminiviridae)，也称联体病毒，是一类广泛发生在热带、亚热带地区植物上的,具有两个单链DNA，分别产生蛋白质衣壳，具有孪生颗粒蛋白的单链ssDNA植物病毒。

该科是植物病毒中惟一具有单链DNA的单分体或二分体基因组病毒。病毒包裹单分子或两分子闭环状ssDNA，每分子DNA长2.5~3.0kb，总基因长约2.5~5.2kb。病毒复制是经一个双链复制中间体，通过滚环复制，ssDNA合成起始于基因间隔区的一段保守序列TAATATT/AC，病毒基因双向转录，在基因间隔区具有转录起始点。大多数双生病毒的增殖部位局限于植物韧皮部组织，在细胞核中形成病毒粒子聚集体。典型的双生病毒为18~30nm，每个单链大小为2.5~3.0knt。根据基因组结构、寄主范围等,可分为玉米线条病毒属(Mastrevirus)主要侵染禾本科、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)、莱豆金黄花叶病毒属，主要侵染双子叶。玉米线条病毒属和甜菜曲顶病毒属的病毒成员由叶蝉传播，持久性，但不经卵传染，有单组分基因组；莱豆金黄花叶病毒属的病毒成员由粉虱传播，含有双组分基因组。

(3)

dsDNA病毒双链环状DNA，分子量5×106u，如花椰菜花叶病毒（CaMV)，。常可在寄主细胞内堆积，形成内含体。(4)

dsRNA病毒基因组有10～12个片段，每段分子量0.8×106～2.6×106例如植物呼肠病毒、三叶草伤瘤病毒和水稻普通矮缩病。（5）（-）ssRNA病毒包括弹状病毒科，如莴苣坏死黄花病毒、马铃薯黄矮病毒。该RNA链为非感染性的，没有与核糖体的连接点，或者翻译产物无意义。以其为模板产生互补的RNA，起信使RNA作用。2侵染过程及相关问题（1）伤口侵入，表皮毛通常为侵染位点，外突原生质连丝可能参与病毒侵入过程。（2）通过媒介或人工擦伤的细胞壁来感染（3）病毒侵入寄主细胞后，存在脱外壳过程，且脱外壳在细胞的不同地方完成。3病毒的复制病毒的复制是很复杂的问题，不同于真核生物DNA复制程序。一般一种类型的病毒复制以同样的方式进行。（1）ssRNA病毒RNA具有感染性，可起信使RNA的作用，能翻译产生蛋白，包括复制酶。复制酶首先合成反平行的互补链，然后再优先复制合成与原始链相同的RNA序列。（2）dsRNA病毒类似于DNA基因组病毒，不同于单链RNA病毒，复制酶是病毒粒体的核心组成部分，把核酸上的基因复制成相应的信使RNA，再翻译成蛋白。同时模板RNA仍配对保持完整。（3）含DNA的病毒进入核内形成微染色体---转录成信使RNA-----进入胞浆----翻译成蛋白并反转录合成负链DNA,----合成正链DNA-----包装形成病毒颗粒-----转运并传播RNA病毒复制模型1.吸附；2.侵入；3.脱壳；4.初期翻译RNA多聚酶，合成细胞代谢的抑制物；5.形成复制型；6.形成复制中间型；7.形成子代RNA；8.翻译晚期蛋白质(合成病毒蛋白质)；9.子代RNA与病毒蛋白质装配，形成成熟病毒；10.释放(a→a′表示病毒感染后可见到细胞核的变形)

DNA病毒复制模型1.吸附；2.穿入；3.脱壳，脱出的DNA向核内移动；4.转录mRNA；5.转录“早期蛋白质”；6.复制子代DNA，合成与转录晚期mRNA；7.带有遗传信息的晚期mRNA在细胞质中移动并翻译病毒蛋白质；8.合成的病毒蛋白质向核内移动；9.病毒DNA和蛋白质装配形成成熟病毒粒子；10.细胞崩解，病毒释放4病毒蛋白的合成通常是利用寄主核糖体系统，翻译病毒专一的RNA（基因组或转录得到的信使RNA),并且基本上都是利用寄主细胞质核糖体，受放线菌酮抑制。5病毒在植物中的移动和积累(1)病毒的移动通过胞间连丝在细胞间移动，通过维管系统从不同组之间转移，但与CP蛋白和运动蛋白有关。

(2)病毒的积累不同病毒在植物中可达的浓度极不相同，并且和寄主植物种类、生长阶段、组织部位有关，同时受温度等环境条件影响。病毒可以分散在细胞质或者以多种形式聚集。例如各种内含体主要是由病毒粒体组成。6植物病毒致病相关基因6.1外壳蛋白基因（coatproteingene）外壳蛋白对病毒RNA具有保护作用，防止病毒核酸被细胞内酶降解。外壳蛋白不仅是病毒粒子的结构亚基，同时协同介导病毒的长距离运动。会大大提高感染效率和发病程度。有时在非寄主植物和抗性寄主上起无毒基因作用。并且CP基因可介导植物抗病性。

R.Beachy(1986)首次将TMV的CP基因转入烟草，培育出稳定遗传的抗病毒工程植物以来，已经克隆了至少15个病毒组中30种病毒的CP基因，并成功转化了20多种植物，其中一些植株已经进入田间试验。

CP基因的抗性机理：（1）抑制病毒脱壳。（2）干扰病毒的复制。（3）限制病毒粒子的扩展与运转。（4）CP基因所表达的mRNA与侵入病毒RNA之间相互作用（RNA介导的病毒抗性）。存在的问题（1）多表现为延迟发病和降低发病严重度，免疫类型和高抗类型较少。（2）具有潜在危险性。6.2复制酶基因（replicasegene）

病毒编码的复制酶蛋白存在多个保守序列，其中一个是存在于所有RNA聚合酶中的Gly-Asp-Asp（天门冬）三肽基元序列（GDDmotif）,对维持聚合酶活性必不可少。另一个保守序列是三磷酸核苷酸结合结构域（NTPbindingdomain），在病毒复制时的解螺旋过程中起重要作用。

Zaitlinetal(1990)将TMV的54KD蛋白基因转入烟草并获得抗性烟草后，国内外陆续报道了此类由病毒非结构蛋白基因介导的植物对病毒的抗性。复制酶介导抗性的特点：

（1）对完整病毒粒子和裸露病毒RNA均具有高度抗性。（2）抗性水平与整合到染色体上的基因拷贝数无关。（3）抗性持续时间长，并对高温（31℃）不敏感。

（4）具有明显的株专化性。抗性机理：

（1）在蛋白质水平上，复制酶蛋白在病毒的侵染过程中作为一种调节蛋白发挥正常功能，从而打破了病毒正链和负链复制的平衡或干扰了控制复制酶活性的反馈抑制途径。

（2）在RNA水平上，转录出的mRNA与病毒的复制酶进行了无效结合而抑制其正常功能，或者是mRNA诱导了植物的自然抗性。

缺损型复制酶基因也可以介导抗性。T.M.Andersonetal(1992)将TMVFny株系的RNA内部缺失94个核苷酸后导入烟草，结果，缺失造成ORF的移码，其翻译产物只有完整的97KD蛋白的75％左右，但仍然表达对CMV的高度抗性。6.3运动蛋白基因（movementproteingene）病毒基因编码的基因产物MP能与胞间连丝结合，使胞间连丝可以通过物质的孔径增大，以允许病毒粒子或基因组核酸进入邻近细胞中，从而实现病毒在细胞间的运动。

研究证明，完整的TMV的MP基因表达并不能介导抗性的产生。M.Lapidotetal(1993)&SIMalyshenkoetal（1993）将TMV的缺陷型MP（dMP）基因转入烟草后能获得抗TMV植株，进一步研究表明，转dMP基因的烟草不仅对TMV，还对其他病毒如CMV、BMV等具有不同程度的抗性。由此可见，各种病毒MP之间虽然缺乏同源性，但具有相同的功能。

抗性机制：由于缺陷型MP与野生型MP竞争胞间连丝上的结合位点而实现的。6.4卫星病毒（satelliteRNA）

某些病毒除基因组外，还伴有一些小片段RNA，它们本身并没有编码外壳蛋白的遗传信息，称为卫星RNA。携带卫星RNA的病毒称为辅助病毒。迄今已报道有6组共26种植物病毒带有卫星RNA。

卫星RNA对植物病毒的影响有3种表现：加重症状；无调节作用；减轻症状。1986年，Baulcombe等首次将CMV的satRNA克隆转入烟草，获得了抗CMV的基因工程植株。

卫星RNA与病毒基因组争夺病毒复制酶。由于卫星RNA能更有效地占据RNA复制酶，而且其分子小、复制周期短，因此，随着复制循环的增加，satRNA的复制量远远大于基因组RNA复制量，最终是病毒基因组的复制受阻。

虽然卫星RNA只需低水平表达，不产生异源蛋白，但这种抗性仅在侵染晚期发挥作用，而且转基因植物体内减轻症状的卫星RNA有可能突变成加重症状的卫星RNA，因此具有一定的潜在危险性。6.5核酶基因（ribozymegene）

核酶是一类具有特殊二级结构、能特异性催化切割自身及其它RNA分子的小分子RNA。广泛存在于一些类病毒和病毒卫星RNA序列中。根据核酶的结构可分为锤头型和发夹型，其中锤头型核酶较为普遍。人们可根据核酶可切割任何生物的RNA，而且对底物作用位点的碱基序列要求不严格这一特性，设计出切割已知序列的病原性RNA人工核酶。目前，人工核酶在植物抗病毒方面，也成功地在体外合成了能切割马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTV）等的基因组RNA的核酶、能切割苹果锈果类病毒的核酶等，但是，在转基因植物水平上的进展缓慢。体内表达不如体外表达有效。

该方法也存在潜在危险性，即核酶可能将细胞RNA作为靶RNA切割而破坏细胞正常功能。6.6蚜传因子也称辅助因子(Helpercomponent,简称HC)：在蚜虫传播的非持久病毒的寄主细胞中，发现有一种病毒编码的蛋白（HC-Pro)与传毒有关，如除去它，蚜虫也就失去传毒能力，这种辅助因子被称为蚜传因子。最早在马铃薯Y病毒侵然的植物中发现，具有协生作用，并帮助长距离运输。但辅助因子的作用方式尚未完全明确。7.TMV基因组及其编码蛋白的功能

烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）属于烟草花叶病毒属。该属基因组编码四种蛋白，大小分别为126kD、183kD、30kD和17.5kD.

其中126kD和183kD蛋白参与病毒的复制，称为RNA依赖的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRP）的亚基；183kD的蛋白是126kD蛋白的阅读框终止子通读的产物。30kD蛋白参与病毒在寄主细胞间的移动，称为运动蛋白（Movementpro2tein，MP）。

17.5kD的蛋白为病毒的外壳蛋白（Capsidprotein，CP）。

3×1041.26×1051.83×1055.4×1041.75×104TMV基因组结构示意图5’运动蛋白3’CP蛋白复制酶涉及RNA复制7.1

126kD/183kD蛋白

烟草花叶病毒通过机械伤口或者借助媒介昆虫进入细胞内，在病毒颗粒部分脱壳露出基因RNA的5′端时即侵染后1-10分钟内，翻译开始首先合成126KDa和183KDa的两种蛋白质。183KDa是由126KDa基通读而产生，Tyr插在这个琥珀型终止子上，有6个保守的核苷酸。

两种蛋白功能

烟草花叶病毒复制所需依赖RNA的聚合酶由两部分组成：一是由寄主提供的亚基，一是由病毒编码的特异的复制酶亚基组合成有专一性的全酶。[2]183KDa有RNA依赖的RNA聚合酶的结构，126KDa的C端有类似于螺旋酶和甲基转移酶的基本结构。所以，这两种蛋白质在TMVRNA的复制过程中起重要的作用。

7.2运动蛋白（MP）运动蛋白（MP）是TMV的运动蛋白质，在整个TMV的表达蛋白质中比例很小。运动蛋白是在病毒复制过程中形成的。以TMV+RNA为模板的3′-端开始复制合成全长的（-）RNA，形成双链，称复制型RNA（replicative，RF型）。在感病细胞与膜相连的病毒合成中除发现RF型外，也发现有以（—）RNA为模板同时合成多达5～6条的（+）RNA，称为复制中间型（replicativeintermediate，RI型）。这些（+）RNA的出路有三：一是被外壳蛋白包装形成子代病毒颗粒；二是进一步作为模板形成RF→RI；三是做mRNA，而1.5Kb和0.7kb分别翻译为30KDa和外壳蛋白。运动蛋白的功能

烟草花叶病运动蛋白的基因全长为807bp.TMV的运动蛋白（30KDa）与TMV在植株体内扩散密切相关，主要功能是介导TMV在临近细胞间的运动（Cell-to-cellmovement），且MP的功能是高度保守的。研究表明MP定位于胞间连丝（Plasmodesma），可能与细胞骨架的某些因子形成一种核孔复合物，有利于转运TMV基因组通过植株的维管系统，侵染整个植株。而30KDa蛋白质与新合成的子代病毒RNA结合产生有两个重要影响：一是使TMA-RNA不折叠而成舒展的线性；二是使胞间连丝改变构型，通道变宽，30KDa蛋白质-RNA复制物可鱼贯通过。因此，30KDa蛋白质较早地以亚基因组形成被表达，有助于病毒在体内的扩展和增殖。

3外壳蛋白（CP）

TMV的外壳蛋白有156～161个氨基酸，共有2130个亚基，亚基右螺旋排列。外壳蛋白质在侵染细胞中表达量是最大的，占整个细胞总蛋白质的10%.复制过程种，形成的部分（+）RNAmRNA，而0.7kb翻译为外壳蛋白。外壳蛋白对TMVRNA具有保护作用。外壳蛋白不仅是病毒粒子的结构亚基，同时协同介导病毒的长距离运动。TMV在植物体内的移动必须以外壳蛋白聚集体的形成为前提。

8花椰菜花叶病毒（CaMV）基因组

病毒粒子为二十面体对称(T=7)，直径为54nm，其外壳由420个蛋白亚基组成，该病毒在自然条件下通过蚜虫以非持久性方式进行传播，侵染十字花科植物，但不在蚜虫体内增殖。

CaMV基因组dsDNA呈环状，大小约为8kb，含有8个ORFs，其中Ⅰ－Ⅵ为主要ORFs，Ⅶ和Ⅷ为两个附加ORFs，在Ⅵ和Ⅶ之间还有一个大的基因间隔区(intergenicregion)，双链DNA上有3个缺刻，1个(△1)在负链(α链)上，另外2个(△2和△3)在正链(β1和β2链)上。除了第Ⅶ基因外，其余的7个基因相距很近，甚至有部分重叠(如下图)。蚜传因子外壳蛋白反转录酶内含体蛋白与复制有关蛋白运动蛋白

(二)花椰菜花叶病毒的转录与复制

当CaMV病毒粒子侵人细胞后，首先在细胞质中脱去外壳，然后病毒基因组dsDNA进人细胞核内，并且在核内其基因组dsDNA的重叠区核苷酸被去除，缺刻经过共价结合形成完整的闭环dsDNA，这一闭环dsDNA再与寄主组蛋白结合生成一个微型染色体(minichromosome)，最后病毒微型染色体在宿主细胞RNA聚合酶的催化下，以一条负链DNA为模板转录生成2个多聚腺苷酸化的RNA分子，即35SRNA和19SRNA(如下图)。9.黄瓜花叶病毒（CMV)病毒粒子为二十面体对称(T＝3)，直径26nm，由180个外壳蛋白亚基构成，在病毒悬液中，PH、二价阳离子都会使病毒粒子的直径和构型产生可逆性的变化。BMV基因组有3个RNA组分，即RNA1(3.2kb)，RNA2(2.5kb)和RNA3(2.1kb)，每个RNA组分的5’端有帽子结构，3’端有Trna样结构，并带有假结(pseudoknot)，能接受酪氨酸(Tyr)。

RNA1编码单一的蛋白质，分子量为l09kD，位于N末端和C末端的氨基酸基序分别类似于甲基转移酶和解旋酶；

RNA2单一ORF翻译合成94kD蛋白，蛋白产物有聚合酶样的区域，这两种蛋白质与病毒基因组RNA复制密切相关；

RNA3有2个ORF，一个ORF编码32kD蛋白，它影响病毒的宿主嗜亲性和介导病毒在细胞之间运动，另一个ORF编码20kD外壳蛋白。

第二节植物病原细菌的致病相关基因（一）植物细菌基因组的特点同于一般原核生物基因组，包括染色体基因组和质粒基因组两部分。染色体是一个高度折叠的环状DNA大分子，大小约为3×106～5×106bp，可携带500基因。游离于染色体的一定区域，没有包膜包被。质粒是细菌染色体外基因组，也是环状DNA分子，并能独立复制。DNA分子量在106u～108u，所携带基因比染色体少。但一般每个细菌菌体内包含1～多个质粒。1基因克隆的策略和研究方法1.1基因克隆策略由里及表的研究途径，创建突变体-通过基因标记和互补法获得基因，再推断其产物，并证明其致病。（1）方法导向（2）概念导向（3）异源基因克隆法1.2突变诱变方法1.2.1物理诱变1.2.2化学诱变1.2.3转座子诱变突变方法1.物理诱变紫外线（UV）、X射线和γ射线诱变；离子束诱变，离子束是元素的离子经高能加速器加速后获得的放射线；中子

2.化学诱变化学诱变剂：碱基类似物、亚硝酸如亚硝基胍(NTG）、丫定橙染料、烷化剂如甲基磺酸乙脂（EMS）等3.转座子插入突变野生型细菌的基因组文库物理和化学诱变获得的突变体两亲交配或三亲交配进行功能互补获得能恢复突变体表型的阳性克隆克隆片段的亚克隆分析和进一步功能互补验证基因的克隆、测序和序列分析热激或电激转化转座子质粒接合实验转座子插入突变转座子诱变致病性测定，获得致病性发生变化的突变体获得相应的突变体以转座子的侧端序列为探针进行Southern杂交，确定转座子插入的拷贝数，明确突变表型是由于转座子的插入引起得突变体的遗传稳定性分析Fig.Structuralorganizationofthepgi(A)andhrpX(B)lociofX.

campestris

pv.citriandofplasmidsderivedtherefrom.(A)Restrictionmapofthegenomicregioncontainingpgishowingtheorientationofthegene(horizontalarrow)andthesiteoftransposoninsertioninthemutantXT906.(B)RestrictionmapofthegenomicregioncontaininghrpXshowingtheorientationofthegene(horizontalarrow)andthestructureoftheplasmidpUW10PGUS,whichcontainsanhrpX::gusfusiongene.

1.3基因文库的构建

将细菌的基因组切成许多片段，分别连到载体上，构建一个能携带该菌所有基因信息的克隆库。☞

构建基因文库常用的载体有质粒（plasmid）、黏粒（cosmid）和λ噬菌体(phaseλ)。适用于作基因克隆的质粒载体必须具备3个共同的组成部分，即复制因子、选择标记和克隆位点。

☞理想基因文库应具备的条件：（1）以一种稳定的形式含有基因组DNA的序列。（2）克隆总数不宜过大。（3）文库的克隆片段大小必须足够包含一个完整的基因。（4）克隆片段大小适应于载体的容纳能力，便于进行酶切图谱分析。（5）应从少量的起始材料进行构建并易于筛选理想的片段。（6）克隆片段之间需要有部分片段重叠以利于chromosomewalking。（7）克隆片段应易于从载体上切下而不带有任何载体序列。（8）文库应能在克隆不损失的情况下得到扩增，而且能长期保存。细菌文库构建常用载体1质粒载体如PBR322PUC系列（2）噬菌体载体包括插入型和替代型两种一般可容纳15-23Kb的外源DNA片段（3）柯氏质粒载体又称粘性质粒（cosmid),是由λ噬菌体的cos片段和质粒复制子组成。能自主复制，可容纳大约45Kb的DNA片段。1.4基因克隆1.4.1转座子表签法1.4.2鸟枪法

在已获得标记基因突变体和基因文库的基础上进行，用基因库互补突变体筛选使图变体表型恢复的克隆。该克隆含有目的基因功能片段的序列，并将此克隆转移到E.coli中得到纯系克隆，在与突变体互补进行验证。1.4.3基因功能互补法常用来克隆控制寄主范围的基因如无毒基因。

1.5克隆片段的亚克隆分析2与病理过程有关的基因

植物病原菌的侵染过程一般包括趋化性、吸附、定植和侵入。已鉴定出土壤农杆菌的一条染色体基因chvE与其细菌的趋化性有关，此外，该细菌染色体上的picA基因还影响细菌的聚集而与毒性有关。

A.Kelman等用转座子诱变方法获得了青枯假单胞菌类似多型性表型转换的现象，并在分子水平上进行了研究，该基因为phcA.2.1与病原菌侵染有关的基因

2.2决定显症的基因

植物病原细菌的症状类型与其致病生化因子有密切关系。如细胞降解酶与组织浸离症状有关；产生坏死症状的病菌如丁香假单胞引起的各种叶斑病都涉及到毒素的作用；毒素和多糖还和植物萎蔫症状有关。有关这些基因的克隆、结构鉴定和功能分析早已展开并取得很大进展。

۞

黄单胞菌中一个800bp的opsX基因参与LPS的生物合成和修饰以及诱导水渍状反应；柑桔黄单胞的pthA基因是引起增生性溃疡症状所必需的。D.W.Gabriel,etal(1995)2.3决定寄主范围的基因2.3.1正向调控寄主范围的基因根癌土壤杆菌（Agrobacterium

tumefaciens）青枯假单胞菌（Pseudomonassolanacearum）黄单胞菌水稻白叶枯枝病致病变种（X.Oxyzae

pv.oxyzae）2.3.2负向调控寄主范围的基因

植物病原细菌的无毒基因是负向调控寄主范围的基因，无毒基因直接产物或间接产物作为激发子与相应抗病基因产物识别诱导寄主防卫基因表达，从而表现小种－品种互作的不亲和。无毒基因失活或缺乏相应的无毒基因则表现小种－品种互作的亲和反应，所以无毒基因的作用是病原菌小种对不同品种的寄主范围的负向调控基因。此外，负向调控寄主范围的基因也可以表现在不同致病变种的致病能力上。植物病原细菌无毒基因的克隆

B.J.Staskawica

（1984）首先通过基因互补法从大豆丁香假单胞6号小种中筛选到一个具有无毒基因功能的克隆，Napoli（1987）将此基因命名为avrA。此后，已从丁香假单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯假单胞中克隆到40多个无毒基因。无毒基因的表达和调控以P.syringae

pv.glycinea中avrB为代表，其不能在富加培养基上表达，但可以在基本培养基上表达。其表达水平依赖于碳源。在侵染期间，avrB在感病或抗病寄主上都能高水平表达，在非寄主植物上也能表达，说明表达不受特异性植物因子调控。以X.campestris

pv.VesicatoriaavrBs3为代表，能在富加、基本培养基以及植物上组成性表达。这类基因的表达不依赖于hrp基因簇，但无毒表型的出现需要有功能的hrp基因，可能是需要hrp基因编码的无毒蛋白通道。无毒基因的生理功能

研究表明,许多植物病原细菌中存在着无毒基因的隐性同源序列,但这种同源序列已丧失了诱导过敏性坏死反应的功能。说明无毒基因除了有诱导过敏性坏死反应的功能外，还有其自身的生理功能。

无毒基因是病原物遗传因子，除诱导寄主植物（含抗性基因）产生过敏性坏死反应外，还具有决定病原物致病性或适应性的功能。无毒基因的概念是相对的，在一种病原物中起无毒基因作用而在另一种病原物中起致病作用。无毒基因与hrp基因互作

无毒基因通常在体外、腐生或非致病细菌中并不表达。因此，一般情况下无毒基因产物不足以在植物中诱导过敏反应，必须依赖于一个具有完全功能的hrp基因介导的机制分泌。近年来的研究表明，作为效应分子，无毒基因产物是通过hrp基因簇所编码的Ⅲ型通道分泌系统运送至细菌细胞外与寄主发生相互作用的。2.4决定病原菌致病性或毒性的基因2.4.1胞壁降解酶基因

◆果胶酶基因果胶酶是软腐欧氏杆菌的重要致病因子，并在萎蔫性病害（P.solanacearum

）中也起作用，现已在至少5种病原细菌中克隆到果胶酶基因。除此之外，在青枯假单胞菌已鉴定出4种胞外酶基因。

◆

纤维素酶基因

◆

蛋白酶基因

编码纤维素酶基因已在软腐欧氏杆菌和青枯假单胞中得到克隆，其主要类型都是内聚葡聚糖酶基因。

在荧光假单胞（P.flouorescens）胞外酶对马铃薯块组织的浸离作用研究中发现，蛋白酶有软化薯块组织的浸离作用。王金生等（1984）研究表明，3中软腐病菌产生的蛋白酶在离体条件下对马铃薯块组织有较强的浸离力。目前已从软腐欧氏杆菌中克隆了许多蛋白酶基因并对其产物特征进行了研究，但这些基因在致病过程中的作用及其调控机理尚不清楚。2.4.2毒素基因

植物病原细菌的毒素一般是低分子量的非寄主专化性毒素。这一特征有利于对毒素进行遗传分析，又由于生物测定是可以敏感微生物代替寄主植物进行生物测试，因此筛选程序简单、快速。目前已对4种丁香假单胞致病变种的毒素进行了遗传分析。

致病变种／毒素TOX菌株类型毒性表现pv.tomato/coronatine

Tn5突变体仅产生小病斑，菌群增长不大

pv.phaseolicola/phaseolotoxin

UV突变体菌群发育正常，但无症状出现pv.syringae/syringomycin

Tn5突变体在樱桃上降低毒性或完全丧失毒性pv.tabaci/tabtoxin

自然突变体接种3d细菌生长曲线与野生型不同2.4.3胞外多糖基因

研究证明，在青枯病菌、梨火疫病菌、玉米细菌性枯萎病菌和甘蓝黑腐病菌等植物病原菌中胞外多糖与其致病性有关。2.4.4植物激素基因

致病细菌诱导植物组织过度生长是由于细菌产生植物激素的作用。这些激素的遗传决定因子在油橄榄癌肿病假单胞菌和根癌土壤杆菌中已有详细研究。2.4.5hrp

基因

（hypersensitivereactionandpathogenicitygene)是决定病原菌对寄主植物致病性和诱导非寄主植物过敏反应的基因

►Hrp基因的鉴定

P.B.Lindgren(1986)用转座子Tn5对菜豆晕斑病菌（P.syringae

pv.phaseolicola）进行随机插入诱变，筛选出6个突变体，它们既失去在感病菜豆品种上的致病性，同时也不再引起非寄主植物如番茄、大豆、烟草和豇豆的过敏性坏死反应。Southern杂交和标记交换分析证明，这些突变体表型改变是由于单个Tn5插入的结果。从野生型基因文库中筛选到一个黏粒pPL6，可以恢复所有6个突变体的hrp突变表型，说明该黏粒上带有hrp基因，且hrp基因是由多个基因组成的基因簇。►

Hrp基因的结构和功能保守性

以P.s.pv.syringae的hrp基因为探针与该病原的其他8个致病变种的基因组DNA进行杂交，结果都表现出同源性，但不同致病变种间的杂交信号强度有差别。研究证明，不同病原细菌的hrp之间也存在同源性，E.amylovora

的hrp至少与8种植物病原细菌基因组DNA有同源性，其中包括在植物中不引起HR的E.stewartii和E.chrysanthemi。此外，还发现非病原细菌E.coli也含有一些能互补E.amylovora

hrp

突变体的基因。

根据hrp基因的DNA杂交和异源互补研究结果，植物病原细菌可以归类为两组（1）包括青枯假单胞和甘蔗黑腐黄单胞的致病变种，其hrp基因簇是共线性的，以相对较高的严谨度相互杂交，且同源性涉及到hrp基因的大部分；（2）包括丁香假单胞的致病变种和梨火疫病菌，其hrp基因在同一组菌之间具有同源性，但两组菌之间的hrp基因不存在同源性。植物病原菌中的hrp基因的广泛存在及保守性说明了许多不同植物病害具有共同的机制，并且可能编码与病害表达有关的具有致病功能的因子，但其随病原细菌的不同而有差异，hrp基因的DNA序列在不同类型生物体之间的相似性也说明了它们在系统发育中的高度保守性。►

Hrp基因的表达和调控环境诱导和抑制信号植物成分的诱导调节基因►

Hrp基因产物及其功能

Hrp基因是一类基因产物未知的基因，已报道的产物多是根据Hrp基因的DNA序列分析推测出来的。

1992年韦忠民等首先从E.amylovora中分离出一个激发过敏反应的蛋白，定名为HarpinEa

由Hrp基因编码。该蛋白为细菌外膜相关蛋白，富含Gly

，热稳定，对蛋白酶敏感，不具泌出蛋白特性。功能：（1）调节蛋白的功能；（2）跨膜蛋白泌出功能；（3）编码无毒基因功能；（4）调节无毒基因表达功能；（5）信号识别功能。2.4.6dsp

基因

只影响寄主植物的侵染能力，而不影响在非寄主植物上诱导过敏反应能力的基因称为dsp

基因。它们与病菌的侵袭力和代谢能力有关。一般认为，dsp

基因在其基因组中是分散排列的，而在质粒上是成簇排列的。2.4.7外泌基因2.4.8致病性调控基因

是指那些不直接编码致病因子但对致病因子产生的总体水平发生影响的基因。如globalregulatorygene和phenotypeconversion,PC。2.4.9编码未知产物的基因3质粒及其在致病中的作用3.1质粒的特征及分离3.2质粒在决定致病性或毒性中的作用植物病原细菌决定致病性或毒性的基因可以在染色体上，也可以在质粒上。质粒基因可包括无毒基因、hrp基因以及编码毒素和植物生长素的基因。3.3质粒编码的非致病特性3.3.1生态适应和进化作用

质粒的存在使植物病原菌对环境产生适应能力。一方面是质粒在群体中的转移，使许多可利用的基因得以传播和扩散，同时提高了细菌群体DNA复制的效果。另一方面，质粒编码的性状如产生细菌素和营养能力，增加了细菌在新环境中的适应和与其他细菌竞争的能力，对抗生素、重金属和紫外线辐射的抗性增加了细菌在不良环境中存活的机会。质粒基因的复杂性是细菌生长进化的产物。3.3.2细菌素（bactrocin）的产生

自1946年Fredericq报道大肠杆菌素（colocin）后，至今已报道了100多种细菌素。澳大利亚学者Kerr(1972)分离到一株能产农杆菌素84（Agrocin84）的放射土壤杆菌菌株84，该菌株发酵后产生的A84对苹果属、梨属、山楂属和蔷薇属等许多属植物的根癌并具有较强防治作用，目前该技术已在澳大利亚、美国、加拿大、英国、意大利和希腊等国家实现商品化生产而应用于大田防治。3.3.3用重组质粒向病原细菌导入新的基因

将从费氏弧菌（Vibrio

fischeri）分离的荧光素基因导入植物病原细菌后可使这些细菌的细胞形成生物荧光，因此可以利用它们的发光性来监测其在植物和环境中的分布和存活。目前已由实验室把含有Bt杀虫蛋白基因的重组克隆导入生防菌构建成病虫兼治的生防制剂。

双组分调控系统是生物中普遍存在的和相当保守的一种重要调控机制。细菌细胞在环境变化是通过这种调控系统直接或间接地感受和传递信号，调节机体内有关基因的表达或有关蛋白的活性，从而对环境的变化作出反应，使细胞能适应环境的变化。基于对蛋白质AA序列的同源性比较，已经发现近30个双组分调控系统。

4植物病原细菌致病基因的调控机制

4.1双组分系统的基本组成和调节控制组成

典型的双组分调控系统有感受蛋白（sensor,modulator,tranmitter）和调节蛋白（regulator,effector,receiver）组成。分别由两个不同的基因编码。所有双组分调控系统的感受蛋白和调节蛋白在AA序列上具有高度的同源性。感受蛋白：C末端250个AA序列具有明显的同源性，在这一区域中，有5个小区表现高度的保守性；N末端虽然不具同源性，但是均有2个疏水区。调节蛋白：N末端120个AA序列是高度保守的，一些调节蛋白的C末端区也具有同源性。根据其同源性，可将目前已发现的调节蛋白分成5类，其中3类C末端具有一定的保守性；一类无保守性；另一类其分子量较小，近又保守的C末端区域组成。调控机制

感受蛋白通过N末端感受信号。然后保守的C末端与调节蛋白的保守N末端互相作用，将信号传递给调节蛋白。这种信号的传递是通过磷酸化或去磷酸化作用实现的。在不少双组分调控系统中，已经证实感受蛋白是磷酸化激酶，其活性区正是C末端的保守区。在这一区域中，有一个完全保守的His蛋白激酶，是感受蛋白自身磷酸化位点。感受蛋白在接受环境信号后，能将磷酸基团转移到调节蛋白上，使调节蛋白磷酸化，被磷酸化的调节蛋白即具有了调节其他相关基因表达的活性。有的感受蛋白还具有磷蛋白磷酸酶的活性，可以通过去磷酸化作用是被磷酸化的调节蛋白失去活性。输入信号感受蛋白调节蛋白NCCNP输出信号HP4.2土壤农杆菌毒性基因的调控植物释放的信号物质糖ChvE酚类膜外周质细胞质PACGBDEVirG

无活性受体有活性VirA跨膜蛋白1跨膜蛋白25植物病原细菌的致病岛（毒力岛）5.1概念

毒力岛（Pathogenicityisland,PAI）是指细菌染色体上一段具有典型结构特点的基因簇，主要编码与细菌毒力及代谢等功能相关的产物。毒力岛最早是用来描述泌尿道致病大肠杆菌（Ueropathogenic

E.coli,UPEC）染色体上两个分子量很大，编码许多毒力相关基因的，不稳定的外源DNA片段（HackerJ,1997）。随着研究的不断深入，现已在动植物病原细菌中发现了30多个毒力岛。5.2毒力岛的结构特点与功能（1）存在于病染菌软色体上，编码毒力相关基因簇的一个分子量较大的DNA片段。（2）两端具有RS和IS。（3）位于染色体的tRNA位点内或附近，或者与质粒、噬菌体整合有关的位点。（4）其G-C含量、密码使用与宿主染色体具有明显的差异。（5）不稳定并含有一些潜在的可移动成分。（6）编码的产物多为分泌性蛋白和细胞表面蛋白。第四节植物病原真菌的致病相关基因1病原真菌基因克隆的策略和研究方法1.1差异杂交法

分离两个菌株的mRNA群体，并用其中的一个转录成cDNA，然后互相杂交，分离出没有被杂交的特异性mRNA，再将此mRNA转录成cDNA构建探针，从基因组文库中钓取目的基因克隆。

该方法已被成功地用于克隆巢曲霉（Aspergillus

nidulans）的发育调节基因。1.2功能互补法以野生型菌株基因文库为供体，缺失某种性状的突变体为受体。突变体是已知目的基因所编码性状发生明显改变如致病性丧失和与致病性有关的致病生化因子的缺失。因此，用野生型菌株的基因文库向突变体转化可以筛选能使突变体性状发生恢复的基因克隆，获得克隆即含有能互补突变体功能的片段。

该方法已成功用于筛选玉米小斑病菌(Cochliobolus

heterostrophus)交配型基因、玉米瘤黑粉病菌(Ustilago

maydis)的b位点和豌豆根腐病菌（Nectria

haematococca）pda基因。1.3根据蛋白质克隆基因法从纯化的蛋白质氨基酸序列推测基因序列合成探针，标记后从基因文库中或cDNA文库中钓取有关基因。

从黑曲霉（Aspergillus

niger）克隆果胶裂解酶基因D和从番茄叶霉病菌(Cladosporium

fulvum)克隆无毒基因avr9就是利用这一方法。1.4染色体步查（chromosomewalking）法用与目的基因紧密连锁的RFLP标记为探针，从基因文库中鉴定出同源片段，再以此片段克隆为探针鉴定出编码目的基因的基因组重叠区，将这些克隆在进行RFLP分析，从而得到新的RFLP，因为真菌基因组较大，必须一步一步反复巡查，使克隆的功能片段逐步缩短，才能最终获得必需的目的基因。

该方法已用于克隆鉴定控制小种－品种转化性的基因即无毒基因，如莴苣霜霉病菌（Bremia

lactucae）、稻瘟病菌（Magraparthe

grisea）。2病原真菌致病过程的相关基因2.1参与真菌发育调节的基因游动孢子侵染寄主的发育调节基因

鞭毛菌亚门的植物病原真菌的游动孢子是主要侵染结构，主要从根的生长区、根毛发生区和根冠或伤口等处侵染。其侵入并不是随机发生的而是由根和游动孢子表面特殊的诱导因子和受体介导的。分生孢子侵染寄主的发育调节基因

植物病原真菌的分生孢子一般在水中即可萌发，但有时除环境条件外还受外源物质的影响。噬菌体或有机酸等化学物质可影响孢子萌发和附着胞的分化甚至组织侵染发生；番茄叶霉病菌在抗感品种中都可以侵入，但在抗病品种中菌丝在进入气孔后在气孔腔内就被抑制，不能在细胞内形成菌丝网络以及从气孔产生新的分生孢