超声微泡可用于脑胶质瘤靶向药物递送,神经病学论文

超声微泡可用于脑胶质瘤靶向药物递送,神经病学论文血脑屏障〔bloodbrainbarrier,BBB〕对脑组织产生屏蔽作用，减少或消除血液中有害物质〔如毒素、病毒〕对脑组织可能产生的损害，但同时阻碍了药物进入脑组织，给脑部疾病治疗带来障碍[1].怎样通过药物载体或药物递送技术将药物有效穿透BBB到达靶区，成为药剂学研究和脑部疾病药物治疗的关注重点。近期，无创和有限开放BBB的研究遭到关注，如低频聚焦超声联合微泡造影剂可开放BBB[2,3],并且超声微泡已得到临床应用，其安全性和有效性已被证实，如已上市的微泡产品Definity、Optison、Imagent和全氟显。超声破碎微泡可产生空化效应。虽有研究证明低频聚焦超声联合微泡可开放BBB,但要做到高水平、无创可逆、靶向开放BBB,必须在大量实验基础上针对详细微泡和超声条件，讨论最适宜实验参数，包括超声频率、功率、辐照时长和微泡剂量。低频〔1MHz〕超声可有效发挥微泡的空化效应[4,5],不仅能将大量微泡推送至对侧管壁，而且很少对微泡产生聚集作用[6,7].本文通过固定超声频率、功率和微泡浓度剂量，改变辐照时长，确定无创可逆开放脑胶质瘤部位BBB的理想实验参数，并证明超声微泡可用于脑胶质瘤靶向药物递送。材料与方式方法材料脂质微泡根据文献[8]处方和工艺，在超声实验前制备。取大豆磷脂、吐温80、聚乙二醇1500〔4∶10∶100,w/w〕混合，参加10倍量的叔丁醇溶解，加热至65℃混匀，冷冻枯燥24h,得到脂质微泡冻干粉，充入全氟丙烷饱和，临用前参加注射用水2mL,轻摇构成微泡混悬液。微泡大小均一，平均粒径约3.26m,生理盐水稀释后的浓度为5.8108~6.7108/mL,大鼠给药剂量为3mLkg?1.伊文思蓝〔Evansblue,EB,Sigma公司〕；4%多聚甲醛〔重庆市北碚化学试剂厂〕。大鼠C6胶质瘤细胞株购于中国科学院上海细胞库。荷瘤雄性SD〔Sprague-Dawley〕大鼠，体重为280~320g,无特定病原体〔SpecificpathogenFree,SPF〕级，温州医科大学实验动物中心。仪器WDT-V型脑立体定向仪，小型颅钻，ST-III型三维手动推进仪〔西安西北光电医疗器械厂〕；Signa3.0T磁共振成像仪〔GE公司〕；大鼠扫描专用线圈〔上海晨光公司〕；低功率聚焦超声治疗仪〔温州医科大学附属第二医院〕；UV300分光光度计〔上海元析仪器有限公司〕；BT01-100型恒流灌注泵〔保定兰格恒流泵有限公司〕；BMJ-Ⅲ型病理组织包埋机〔常州中威电子仪器有限公司〕；旋转型石蜡切片机〔英国珊顿公司〕；PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪〔常州中威医疗仪器有限公司〕；IX71倒置研究型显微镜〔日本Olympus公司〕；ACASULTMA312型激光共聚焦显微镜〔美国Meridian公司〕。脑胶质瘤模型的建立调整C6细胞数为1106/10L,用台盼蓝排挤实验检测细胞活力95%.腹腔注射1%戊巴比妥钠〔3mLkg?1〕麻醉大鼠，剪去头顶部毛，在内毗连线与头部矢状中线交汇处，纵向头皮切口约1cm长分离，暴露颅骨。将头部固定在大鼠脑立体定位仪上，用碘酒、酒精顺序消毒，铺洞巾。选取大鼠右侧脑尾状核区为靶点，根据大鼠头部立体定向解剖图，确定对应于右脑尾状核的钻孔位置。用牙科钻钻直径约1mm孔，深达硬脑膜外表但不刺破硬脑膜。用微量注射器汲取10L细胞悬液，调节定位仪上的针尖使其触及硬脑膜，进针6mm,后退1mm,使针尖距硬脑膜为5mm,将细胞缓慢注入脑内，注射速度约为2.5Lmin?1,注完后留针约5min,缓慢退针，用无菌骨蜡封闭骨孔，缝合皮肤，切口消毒。手术在无菌环境下操作。对照组大鼠以等体积的培养液替换细胞悬液。BBB开放性检测EB靶点染色EB静脉注射后可立即与血浆白蛋白结合，构成EB白蛋白复合物。复合物分子量大，不能透过完好BBB;但BBB开放时复合物可浸透通过BBB,并且渗出量和BBB开放程度呈正相关。因而可根据脑本质EB染色程度揣测BBB开放程度。大鼠超声辐照后立即尾静脉注射0.2%EB溶液，剂量为2mLkg?1,4h后打开左侧胸腔，生理盐水灌注，至右心房流出灌注液变澄清，再用磷酸盐缓冲液〔pH7.4〕灌注至动物出现肌肉抽搐后，再缓慢灌注30min,然后处死大鼠，断头，取端脑，用4%多聚甲醛溶液固定脑组织，72h后切片。荧光显微镜观察脑组织冰冻切片，在显微镜下观察超声辐照区及周围组织EB染色情况。脑中EB定量检测大鼠超声辐照后尾静脉注射0.2%EB溶液，剂量为2mLkg?1,2h后用生理盐水灌注，取脑，称重。将局部染色的脑组织按10mLg?1湿重浸入甲酰胺中，在60℃水浴中放置24h,当甲酰胺溶液呈蓝色、脑组织呈无色透明状时，取甲酰胺溶液测定620nm处的EB吸收度。EB的分光光度法测定线性范围为0.039~10gmL?1.根据脑内EB浓度计算BBB的EB通透率[g〔EB〕/g〔脑组织〕].磁共振常规及加强扫描磁共振〔magneticresonanceimaging,MRI〕检查包括脑横断面及冠状面T1加权像〔T1weightedimaging,T1WI〕、T2加权像〔T2weightedimaging,T2WI〕及加强T1WI检查。加强检查是通过鼠尾静脉注射0.4mmolkg?1钆喷酸葡胺注射液〔gadolinium-diethylenetriaminepentaaceticacid,Gd-DTPA,广州先灵药业有限公司〕10min后进行。扫描条件为T1WITR560ms,TE27ms,鼓励次数〔NEX〕2,矩阵256256;T2WITR2300ms,TE110ms,NEX2,矩阵256256;扫描层厚2.4mm,层间距2.9mm,视野〔FOV〕56mm70mm.超声参数设置超声探头前端有循环水囊，设置水温25℃。将低频聚焦超声探头连接信号发生器，调节相应电压参数，再连接信号放大器。参数设定为：频率1.0MHz、焦距5cm、声强4W/cm2和焦域2mm.在大鼠颅顶均匀涂抹超声耦合剂，探头中心对准瘤体部位，眼耳连线中点交界处，建立从超声探头到鼠头的连续性通路。超声时长的考察将接种脑胶质瘤细胞16天的荷瘤鼠随机分为对照组和超声微泡组。对照组〔n=5〕经尾静脉注射生理盐水；超声微泡组经尾静脉注射脂质微泡，剂量为3mLkg?1,然后用超声经颅辐照大鼠。超声微泡组按超声辐照时间分为10s组、30s组和60s组，每组10只。各组静注EB溶液，解剖后观察脑组织染色情况。同时通过苏木精？伊红〔hematoxylin-eosin,HE〕染色观察有无组织出血坏死表现。接种时间和超声机会的影响对接种脑胶质瘤细胞第9、16、23和30天的荷瘤鼠分组：非超声静注EB组；超声微泡静注EB组；先超声微泡后静注MR造影剂〔Gd-DTPA〕组；先静注MR造影剂组后超声微泡组。对各组进行解剖后观察或T1加权相加强扫描，测定各组脑瘤部位及脑瘤边缘2mm内的EB浓度。病理学观察取脑组织冠状切片，用常规石蜡包埋，HE染色，显微镜下观察有无组织出血坏死表现。统计分析实验数据以均数标准差〔xs〕表示，两两比拟采用方差齐性检验、t检验。多组间数据比拟采用方差分析，方差分析中两组间均数比拟采用SNK法检验。分析采用SPSS13.0软件包，以P0.05〔差异有统计学意义〕表示。结果1超声时长对BBB开放的影响静脉注射EB后，发现对照组脑组织靶点〔瘤体〕外表呈极淡蓝色〔图1A〕，讲明脑胶质瘤可造成BBB微小开放。超声微泡组辐照区脑组织明显可见EB染色，随超声时间延长，染色程度也加强，华而不实60s组〔图1D〕30s组〔图1C〕〕10s组〔图1B〕。HE染色图中对照组、10s组、30s组显微镜下均未见明显异常，神经细胞包浆、核染色均匀，核仁清楚明晰，核膜完好，血管构造尚完好，未见明显红细胞渗出，如30s组，结果见图2A、B;但60s组见明显异常，有明显红细胞渗出〔图2C、D〕，即长时间超声可显着造成局部脑组织损伤。因而，综合BBB开放效果和组织损伤程度，确定超声时长为30s.对移植脑瘤细胞30天的荷瘤鼠静注EB后超声辐照，并进行脑瘤组织切片，激光共聚焦显微镜下发现对照组〔注射EB〕仅见稀疏点状红色荧光〔图3A、B〕，而超声微泡组〔30s〕辐照区可见大量红色荧光〔图3C、D〕，证明超声微泡可促进EB浸透穿过BBB进入脑胶质瘤组织。2脑瘤生长期对BBB开放的影响脑胶质瘤细胞移植后的不同时期，BBB通透性有较大差异。单独静注EB染色，脑瘤部位染色效果很不明显；但超声微泡操作后，染色程度随脑瘤生长期延长明显加强〔图4〕。在超声条件下，静脉注射加强显影剂Gd-DTPA后，MR检查也呈现靶点BBB开放〔用MRI信号强度表示〕，具有脑瘤生长期依靠性。MRI结果表示清楚，先超声再给造影剂后MRI脑瘤显影效果明显弱于先给造影剂再超声的情况〔图4〕，讲明超声在造影剂到达靶部位外表时进行开放BBB效果最佳。超声机会和药物注射需进行适宜的配合才能获得最强的BBB浸透。结果同时讲明超声不会造成BBB长期损伤，超声停止后，BBB迅速恢复。EB染色后在不同组织中浓度差异可定量判定BBB浸透性。在各时间点〔9、16、23和30天〕，超声微泡组脑瘤中EB一直维持较高浓度〔图5〕，并且与超声微泡组瘤体边缘、对照组瘤体及瘤体边缘中EB浓度相比，差异均具有统计学意义〔P0.01〕。超声微泡组瘤体边缘、对照组瘤体EB浓度一直保持接近，讲明超声微泡可使BBB开放，促进EB进入脑瘤边缘；而脑瘤本身也能造成BBB有限开放，但开放程度远小于超声微泡效应，并且EB很难进入脑瘤边缘部位。讨论检测无创性BBB开放的方式方法包括EB染色法、透射电镜检查法和影像学检查〔加强CT、加强MRI〕，最简便常用的是EB染料法[9].本文充分利用EB染色的特点，从外观、红色荧光、定量检测方面系统考察了超声和脑胶质瘤对BBB开放的影响，准确判定出脑瘤、超声微泡、脑瘤附近神经组织中EB浸透情况和BBB开放程度。Gd-DTPA是水溶性分子，不能通过BBB,但BBB开放后可通过加强MR影像学，灵敏地显示BBB开放，并且可重复操作，没有毁坏性。本文通过MRI检测，发现聚焦超声开放BBB的速度非常快，几乎是即时开放，并且呈可逆性。这与超声照射5min后电镜下观察毛细血管内皮细胞严密连接被打开的结论相符[10].微泡在脑内血液循环时，超声使微泡破裂产生空化效应，但仅限于对脑微血管壁产生影响，打开严密连接，促进局部BBB开放。超声微泡的作用与单纯低频聚焦超声比拟，前者比后者的超声功率降低几个数量级后，仍能开放BBB,操作容易，大大降低了安全性风险，未发生脉管损伤所致的迟发性脑缺血和细胞凋亡[11].低频聚焦超声联合微泡在低声压水平开放BBB时，仅仅使靶区温度升高0.025℃，对周围组织没有任何影响[12].低频低声压下超声辐射力并不破碎微泡，而使大量微泡由管腔向管壁发生数微米至数百微米的移位，并在管壁外表聚集成微泡团，使靶向黏附率增加20~80倍，有利于BBB靶向性开放，提高基因或药物定点释放的准确性和高效性[13,14].本文也证明了超声微泡对BBB开放影响的可逆性。因而该技术在一定参数下是安全的。低频聚焦超声联合微泡开放BBB的技术参数包括超声功率、频率、辐照时长和微泡浓度剂量。微泡组分、直径和浓度不同，则相应的超声频率和功率不同，空化效应也有差异。微泡的生物学效应受超声频率影响较大，超声频率越低，开放BBB需要的超声功率值越低[15?17].固定超声频率、功率、辐照时长，微泡数量增加时，无创可逆开放BBB的