基因克隆载体

第三章基因克隆载体

(质粒载体)载体(P39)概念：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制和功能基因表达调控系统的工具。功能1.运送外源基因高效转入受体细胞

2.为外源基因提供复制能力或整合能力

3.为外源基因的扩增或表达提供条件载体在基因工程中的必要性目的外源DNA很难进入受体细胞目的外源DNA一般不带复制子系统目的外源DNA一般不具备表达的调控系统载体应具备的条件（P38）

1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.具有多种单一的酶切位点（多克隆位点）

4.具有合适的选择性标记

自我复制表达，外源基因的插入不影响其功能的发挥，易于从宿主细胞分离出来5.分子量尽可能小，以提高其载装能力

目的基因能否有效导入受体，并在其中高效表达，很大程度上取决于所用的载体。质粒的基本生物学特征生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并稳定遗传的一类核酸分子常见于原核细菌和真菌中绝大多数的是DNA型（除了酵母的杀伤质粒（killerplasmid）是一种RNA质粒外）绝大多数具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA分子量范围：1－300kb，多数在10kb某些蓝藻、真菌和绿藻中也有发现质粒的存在形式：开环DNA分子(oc-DNA)线性DNA分子(l-DNA)超螺旋DNA分子(scDNA)同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。共价闭合环状DNA分子(ccc-DNA)质粒DNA的复制质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严谨型质粒：分子量大，低拷贝数，1－3拷贝松弛型质粒：分子量小，高拷贝数，10－60拷贝P38质粒的不相容性（P39）在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞内稳定的共存。不相容性质粒：不能共存于同一细胞内不同质粒相容性质粒：共存于同一细胞内不同质粒质粒的不相容性：分子机制两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。一、质粒载体质粒克隆载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体。天然质粒的缺陷天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。（1）分子量大，拷贝数低第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。（2）筛选标志不理想ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。

唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞…….3.2构建质粒克隆载体的基本策略能在受体中进行有效的复制（有复制起始位点）。含多克隆位点含有供选择克隆子的标记基因，如：常用的标记基因：Apr，Kmr，Smr，Tcr基因等DNA分子尽可能小和较高的拷贝数。根据特殊需要，组装各种“元件”，构建不同用途的质粒克隆载体。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。3.3质粒克隆载体的构建(P39)选择合适的出发质粒正确获得构建质粒克隆载体的元件组装合适的选择标记基因选用合适的启动子构建过程力求简单出发质粒含有质粒克隆载体必备的元件：复制起始位点选择标记基因克隆位点启动子和终止子出发质粒（亲本质粒）亲本质粒必须含有质粒克隆载体必备的元件：复制起始位点选择标记基因克隆位点启动子和终止子组装合适的选择标记基因绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。

氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）合适的启动子真核生物基因在原核生物中表达，改用原核生物或病毒（噬菌体）基因的启动子。原核生物基因在真核生物中表达，仍用原核生物基因的启动子。选用外界条件诱导的启动子。(1)质粒克隆载体pBR322pBR322是经人工改造的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，应用广泛。现在已经被许多更优良的新型克隆载体所替代。(P40)pBR322质粒是按照标准的质粒载体命名法则命名的。“p”表示它是一种质粒；“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F．Bo1ivar和R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母，“322'’系指实验室编号，以与其他质粒载体如pBR325，pBR327，pBR328等相区别。pBR322的结构pBR322的构建过程复制起始位点：源于ColE1衍生质粒pMB1。Apr基因：源于pSF124质粒转座子Tn3。Tcr：源于pSC101质粒。pBR322的优点具有较小的分子量，4363bp，可以克隆10kb以下的外源DNA。含有松弛型质粒ColE1的复制起始位点，可在E.coliHB101和E.coliC600等受体细胞进行高拷贝复制。具有两种选择标记基因Ampr和Tetr。插入失活其中有7种限制酶：EcoRV,NheI,BamHI,SphI,SalI,XmaIII和NruI，它们的识别位点是位于四环素抗性基因内部，另外有2种限制酶：ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr基因的失活；还有3种限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨苄青霉素抗性基因（ampr）内具有单一的识别位点，在这个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。这种因DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。当外源DNA片断插入Tcr基因后，导致Tcr基因失活，变成只对Ap有抗性，即通过对抗生素的双抗或单抗来筛选是否有外源片断插入。筛选标记－插入失活（2）质粒克隆载体pUC18/19UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19

(P41)pUC18/19与pBR322的主要差别是用乳糖操纵子的一个DNA片断（466bp）替换了pBR322选择标记Tcr基因。此DNA片断含有乳糖操纵子的启动子、调节因子和β－半乳糖苷酶的α-肽基因。pUC18/19的结构复制起点：来自pBR322质粒。Ampr基因：来自pBR322质粒lacZ的启动子：来自大肠杆菌lacZ’基因：大肠杆菌lacZ的-肽链序列，是LacZ

的氨基端片断多克隆位点：10个连续的单酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。pUC18/19的结构pUC18/19质粒载体的优点①更小的分子量：如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。②选择方便：Xgal显色、抗菌素双重直接选择。③克隆便利：具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④测序方便：pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。选择原理Ampicillin抗性和lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。

蓝白斑筛选Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside）是-半乳糖苷酶的作用底物-半乳糖苷酶作用于Xgal显色反应-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝诱导物：IPTGIPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，不能产生肽！lacZ的肽互补-肽（lacZ’基因编码）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。pUC质粒载体上的lacZ’编码的肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。-互补pUC质粒结构中的lacZ’基因所编码的-肽链（编码β-半乳糖酶基因的氨基末端）可参与-互补作用。这种载体适合于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然质粒和宿主编码的片段各自均无活性，但它们共处一个细胞中时可融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做-互补。质粒克隆载体引入与lacZ’互补的E.coli，在含IPTG和X－gal的诱导培养基中，菌落呈蓝色。如果在MCS区插入一个外源片断，就会使lacZ’基因失活，引入lacZ’互补的E.coli，肽不能生成，就无所谓互补，在含IPTG和X－gal的诱导培养基中X－gal不会被降解，菌落呈白色。IPTG诱导的结果：蓝白斑筛选MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑（教材P94）通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。IPTG诱导的结果：1、具有更小的分子量和更高的拷贝数。2、适用于组织化学方法检测重组体。

质粒克隆载体引入lacZ’互补的E.coli，在含IPTG和X－gal的诱导培养基中，菌落呈蓝色。如果在MCS区插入一个外源片断，就会使lacZ’基因失活，引入

lacZ’互补的E.coli，在含IPTG和X－gal的诱导培养基中，菌落呈白色。（3）农杆菌Ti质粒表达载体的构建(P53)Ti（tumor-inducingplasmid）质粒：根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，Ti质粒中有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA），能转移并整合到植物基因组中，并导致冠瘿瘤的形成。大小因种类而异，在200－250kb之间。章鱼碱型农杆碱型农杆菌素型琥珀碱型Ti质粒分为4个功能区：

T－DNA区：是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，含有编码植物激素和冠瘿碱的基因

Vir区：Vir

区上的基因能激活T-DNA转移，使根癌农杆菌表现出毒性

Con区：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移

Ori区：Ori区上的基因调控Ti质粒的自我复制。T－DNA区Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约25kb。能转移到植物细胞内的DNA片断称为T－DNA（transfer-DNA）T－DNA左右两端边界各有一个25bp长的正向重复序列(左边界，右边界)，在不同Ti质粒中高度保守。

边界序列对T－DNA转移和整合不可缺少；已证实只要保留两端边界序列，虽然中间序列不同程度被外源片断所替换，仍可转移整合到植物基因组中－Ti质粒遗传转化的理论依据。

T－DNA进入植物细胞后，能以单拷贝或多拷贝形式随机整合到染色体DNA上。且T－DNA上的基因能被植物转录系统识别，进行转录。在T－DNA已鉴定出多种基因章鱼碱合成基因（ocs）或胭脂碱合成基因（nos）或其他胭脂碱合成基因。细胞分裂素合成基因位点Shi和控制植物生长素合成的基因位点Roi。在两种基因表达产物的共同作用下，破坏植物内源激素的平衡，干扰植物细胞的正常分裂，引发植物产生肿瘤。Vir区Ti质粒T－DNA上游的一组基因，表达产物可激活T－DNA向植物细胞转移，引发肿瘤，显示致病性。Con区含有与农杆菌之间接合转移有关的基因，受宿主合成的冠瘿碱激活，使Ti质粒在细菌间转移。Ori区调控Ti质粒的自我复制乙酰丁香酮/羟基乙酰丁香酮植物根部损伤部位会分泌出酚类物质乙酰丁香酮/羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质能诱导Ti质粒上的vir基因以及根癌农杆菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根癌农杆菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，转化植物根部细胞。Ti质粒介导转化的过程①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着②根癌农杆菌对植物信号物质的感受③根癌农杆菌Ti质粒上的vir基因以及染色体上操纵子的活化④vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝，T-DNA复合体的产生⑤T-DNA复合体在RB序列的引导下定向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中Ti质粒介导转化植物细胞示意图天然的基因工程研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。天然的基因工程1、Ti质粒是一种天然的质粒表达载体，外源基因组装在T－DNA上，有可能引入植物细胞。2、转基因的细胞只能分裂，而不能分化成植株，不能达到选育转基因植物的目的。3、通过改造T－DNA，构建了一系列Ti质粒表达载体。Ti质粒本身存在的缺陷转化细胞在生长过程中会产生植物激素，从而破坏受体激素的平衡，阻碍转化细胞的再生，因此需将参与合成植物生长素和细胞分裂素的基因剔除冠瘿碱合成基因对转基因植物意义不大，因此也可删除Ti质粒分子量过大（200～800kb），小一些利于操作，因此可除去不必要的大片段DNA需加入大肠杆菌复制起始位点，以利于在大肠杆菌中的操作和保存pCAMBIA1300图谱潮霉素抗性基因左边界右边界复制起点卡那霉素抗性基因(4)穿梭质粒载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

常用的穿梭质粒载体大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体大