实验4 微生物菌落的观察和细菌的运动性观察

实验四

微生物菌落的观察和细菌的运动性观察目的要求学会观察、识别各种不同的微生物菌落的方法。掌握平板菌落计数的方法，运用所学的知识详细的描述所分离平板上的各种微生物菌落。了解普通光学显微镜的构造和原理，熟悉其使用的正确方法。

学习并掌握油镜的使用方法，学会用压滴法或悬滴法观察细菌运动性的基本技术。实验原理对于一些难区别的菌落还应该借助显微镜来观察其细胞形态以进一步做出正确的判断。

1.物镜转换器2.接物镜3.游标卡尺

4.载物台5.聚光器

6.彩虹光阑7.光源

8.镜座9.电源开关

10.光源滑动变阻器

11.粗调螺旋12.微调螺旋

13.镜臂14.镜筒

15.目镜16.标本移动螺旋

显微镜的放大倍数和分辨率

1.放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数

2.

显微镜的分辨率

是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力。（一）普通光学显微镜的构造D：物镜分辨出物体两点间的最短距离；NA，数值孔径，是物镜的参数之一；

：入射光的波长（可见光平均0.55m)n:物镜和被检标本间介质的折射率；（空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.52，甘油为1.47，香柏油为1.515。）

：镜口角（即入射角）：是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度。比如，肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm，假如NA=0.65的接物镜，它的分辨力D=½*0.55/0.65=0.42μm以下的两点间的距离就分辨不出来了，即使使用倍数更大的接目镜使其总放大率增加也仍分辨不出，只有改用数值孔径更大的接物镜才行。显微镜的分辨率可用公式表示为：D=λ/2NA

=λ/2nsin(α/2)（二）油镜的使用原理油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。加入中间的介质是一层香柏油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。实验材料实验三所作的平板培养物：A，在细菌培养基上生长的各种菌落；B，在霉菌培养基上生长的各种菌落。实验二所作的试管斜面，酒精灯、接种环等。盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。菌种：大肠杆菌E.coli，枯草杆菌B.subtilis或实验三所培养菌种实验程序Ⅰ（观察描述菌落特征）运用所掌握的各种微生物菌落的特点，观察、识别、描述所做样品的两个平板上的所有菌落,并将结果填入表1中。常用的菌落描述词语：大小：大、中、小、针尖状形状：圆形、隆起、扁平、假根状、不规则状等；边缘情况：整齐、波形、裂叶状、锯齿状等表面情况：干燥、湿润、光滑、皱褶、颗粒状、龟裂状等；表1平板菌落特征描述定义:根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征而设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。对土壤中的微生物进行计数,将结果填入表2中。实验程序Ⅱ（平板菌落计数）表2土壤中微生物计数结果

计数方法:每克土壤的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数

计算结果时，常按下列标准从接种后的2个或3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。

（1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。

（2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜，霉菌以每皿10—100个菌落为宜。

选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。实验程序Ⅲ显微镜（油镜）的使用：

1、用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。

2、打开光源，调节光亮度

3、低倍镜观察：粗调、细调4、依次再进行中倍、高倍观察

5、油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。

6、换片：另换新片，必须从第三条开始操作。

7、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。一、结合标本片的观察，掌握油镜的使用方法；观察各类微生物染色片，边观察边绘图。二、细菌运动性的观察（压滴法）：(1)

制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌放在装有1～2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。(2)取2～3环稀释菌液于洁净载玻片中央，再加入一环0.01%的美蓝水溶液，混匀。(3)用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。(4)

镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。二、细菌运动性的观察（悬滴法）：1.制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加3-4mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。2.涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林（或香柏油）。3.滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。4.盖凹玻片

将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥。5.镜检

先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动）。实验程序Ⅳ（无菌操作技术

）1.用接种环转接菌种点燃酒精灯左手夹住两试管：斜面向上，45～0度角。灼烧接种环右手拔棉塞，管口过火取菌，接种，标记，培养2.平板划线技术用接种环取菌悬液或菌苔。在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，划线，方法如下（划线的方法有很多（平行划线、“