流式细胞仪的原理与应用

流式细胞术原理和应用■姓名：白小燕■专业：微生物学一

简介二构造及工作原理三FCM的数据分析FCM的应用一简介

流式细胞仪(FlowCytometer):是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(FlowCytometry，FCM):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。流式细胞仪的特点单个细胞或微粒分析同时多参数分析速度快：10000个细胞(微粒)/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞或微粒流路(液流系统）流动室 鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5*105~1*106个/ml光路（光学系统）光源滤片电路（检测系统）光电倍增管PMT放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计（分析系统）计算机二构造及工作原理

流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。液流系统流动室InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系统激光光源：目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照强度。

光学系统信号散射光信号

FS细胞大小

SS细胞颗粒性荧光信号

FL1–FITC

FL2–PE

FL3–ECD

FL4–PC5光学系统散射光信号——

细胞大小及颗粒性FSSS光学系统光路（滤片特性）光学系统电路电压调节光电倍增管电压volts增益Gain信号放大方式检测系统电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。细胞DNA含量、RNA含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍，通常使用对数放大器。

检测系统常用荧光染料介绍FITC：绿色525nmPE：橙黄色575nmECD：橙红色610nmPE－CY5：深红色675nmPerCP：深红色675nmPE－CY7：深红色755nm7AAD：深红色675nmPI(碘化丙啶）：橙红色620nm 488nm波长的氩离子激光激发三FCM的数据分析单参数一维直方图纵坐标表示细胞数，横坐标表示相对荧光信号或散色光信号值，单位是道数。2.双参数二维点图显示来自同一细胞的两个参数与细胞数量间的关系。横、纵坐标分别表示两个参数的相对含量。通过分别计算两坐标所表示参数的阳性率来得到实验结果。白血病免疫分型HLA-B27:强直性脊柱炎淋巴细胞亚群造血干细胞计数：造血干细胞移植网织红细胞PNH诊断（CD55、CD59）血小板活化试验1流式细胞术的临床应用四FCM的应用细胞大小细胞的颗粒度细胞表面分子：CD系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：P53细胞功能检测：细胞周期、凋亡2流式细胞术的科研应用概念：白细胞分化抗原(DC)CD(clusterofdifferentiation)指的是分化群或分化簇。在使用CD命名细胞膜表面免疫标志的初期，他专职白细胞膜上的抗原或抗原识别的抗体，故又称白细胞分化抗原。目前“CD”代表的不仅仅是白细胞表面抗原，还有红细胞膜表面抗原、血小板表面抗原、髓系细胞表面抗原及其他组织细胞表面或细胞内的抗原等，研究方法以流式细胞术检测法为主。1、在血液学中的应用：2、细胞周期分析：DNA的含量随细胞周期(G1，S，G2，M)的各个时期呈现出周期性的变化G1期，是细胞RNA和蛋白质的合成期，即DNA合成前期,此时细胞核内DNA含量保持二倍体；进入S期后，DNA开始合成，即DNA合成期,细胞核内DNA的含量介于二倍体至四倍体之间；细胞进入G2期，即细胞分裂前期，DNA含量为四倍体,直到进入M期，即细胞分裂期,细胞分成两个子细胞,M期结束进入下一个细胞周期。1）细胞增殖周期各时相细胞数的比率:

在生物细胞核中，DNA含量随细胞增殖周期时相不同而发生变化。因此，不同种类的细胞，其细胞各期（G0/1期,S期,G2/M期）百分比含量是不同的。亚G1峰检测：凋亡细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞体变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出。染色质浓集是由于凋亡细胞双链DNA发生裂解所致。DNA降解后，形成长度为180-200bp的DNA片段，称凋亡小体。即在流式细胞检测上可出现亚二倍体(G1)峰值。而常规坏死的DNA分解是随机的，DNA片段大小不一，在流式细胞检测上可出现比亚二倍体(G1)峰更