现代生化技术

第十二章酶技术专业：发酵工程第一节酶生物合成的调节技术操纵子学说（雅格和莫诺德，1960年）酶的生物合成是在基因的控制之下进行的。这些基因包括调节基因（regulatorgene）、启动基因（promotergene）、操纵基因（operatorgene）和结构基因（structuralgene）。他们在DNA分子中按一定的次序排列，启动基因、操纵基因和结构基因一起被称作操纵子（operon）。调节基因：可以产生一种阻遏蛋白。启动基因：决定酶的合成能否进行。操纵基因：可以与调节基因产生的阻遏蛋白结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速率。结构基因：决定合成某一种蛋白质或RNA分子结构相应的一段DNA。（一）酶合成的诱导通过添加某种物质，可使酶的合成开始或加速进行，这种作用称为诱导作用。能够引起诱导作用的物质称为诱导物。如：乳糖酶的诱导一、酶合成的调节机制1诱导物的选择诱导物可分为三类(1)酶的作用底物如：大肠杆菌生产β-半乳糖苷酶(2)酶的反应产物如：纤维二糖对纤维素酶有诱导能力(3)酶的底物类似物(最有效的诱导物)如：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷对β-半乳糖苷酶的诱导2酶诱导合成的条件(1)基因必须完整。酶的合成是在基因的控制下进行的，若基因受到破坏或变异，酶的合成将受影响。①若酶所对应的结构基因改变，该酶将无法合成。②若同一操纵子中，第一位的结构基因受破坏，则第二位及其以后的各个结构基因及时完好，也无法合成相应的酶。③若操纵基因变异，将出现两种相反的情况：一是操纵基因变异后，阻抑蛋白不能与之结合，那么将不受诱导物或阻遏物的影响，酶都可以合成；二是操纵基因变异后，与阻抑蛋白牢固结合，是否有诱导物，酶均无法合成。④若调节基因变异，不能合成相应的阻抑蛋白，那么也不受诱导物或阻遏物的影响。(2)阻抑蛋白本来与操作基因的亲和力强，两者原来结合在一起，使酶不能合成。当添加诱导物时，诱导物与阻抑蛋白结合，使其与操作基因分离，才能进行酶的合成。(3)在添加诱导物时，细胞处于环境中，不能有高浓度的分解代谢阻遏物或其他强阻遏物存在，否则将无法诱导。（如乳糖和葡糖糖）3酶诱导合成的检测

(1)胞外酶：在诱导一定时间后，每隔一定的时间取一定量的培养基连同细胞一起测定酶活力，同时测定细胞的量。计算单位细胞量的酶活力，再与不添加诱导物的数值对照，可知诱导效果如何。(2)胞内酶：在添加诱导物后，每隔一定的时间取一定量的细胞，破碎，测定酶活力，算出单位细胞量的酶活力。与不添加诱导物的数值对照，可知诱导效果如何。二、酶生物合成的阻遏1阻遏作用的分类酶生物合成的阻遏作用有产物阻遏和分解代谢阻遏（1）产物阻遏作用产物阻遏是由于产物与阻遏蛋白结合后，使原来不与操作基因结合的阻遏蛋白变构，而与操纵基因结合在一起，使酶的合成受阻。如：色氨酸操纵子酶阻遏（图）(2)分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用是指某些物质(主要是指容易利用的碳源)经过分解代谢产生的分解代谢物阻遏某些酶(主要是诱导酶)生物合成的现象。分解代谢物阻遏作用与环腺苷酸（cAMP）的浓度有关。如下图2酶合成的阻遏与解除阻遏作用(1)使酶的合成受阻在细胞进行酶合成的过程中，添加一定量的阻遏物，如：末端产物、反应产物或葡萄糖等容易利用的碳源。(2)使酶合成的阻遏作用解除必须除去阻遏物，控制阻遏物的含量或添加cAMP.3酶阻遏作用与解除阻遏合成的检测方法一：在酶合成的过程中，添加不同量的阻遏物，然后每隔一段时间，取样分析酶活力和细胞量，与空白试验进行对照，即可检测该物质的阻遏效果。方法二：将细胞从含有阻遏物的培养基中取出，洗净后，重新在含有阻遏物和不含阻遏物的培养基中培养，再比较两者的酶活力和细胞量，亦可检测阻遏物的阻遏效果，并看到解除阻遏合成。第二节酶反应动力学的研究一、酶反应初速度的测定酶催化反应速度：用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。一般多采用单位时间内产物的增加量来表示。测定酶反应速度的步骤：(1)根据酶的催化专一性，选择适宜的底物；(2)根据文献资料或初步试验结果，确定酶反应的温度和pH条件，温度亦可选在25℃(3)在一定条件下，将一定量的酶液加到底物中，开始反应，记录时间。(4)每隔一定时间，取出适量的反应液测定产物生成量或底物减少量。时间间隔开始阶段可以短些，后期可间隔长些。(5)以反应时间为横坐标，产物生成量或底物减少量为纵坐标作出酶反应过程曲线。AOBC时间产物生成量反应初期直线斜率即酶反应初速度酶反应过程曲线二底物浓度对反应速度的影响VVmVm/2Km[s]酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影响Km和vmax的测定如果根据上图求出Km和vmax，常常要测定许多不同底物浓度下的反应速度才能确定。为了方便起见，常常采用其他图解法求得Km和vmax。常用的有双倒数作图法和但倒数作图法等。

单倒数作图法

纵轴截距：横轴截距：斜率：伊蒂-霍夫斯第法

纵轴截距：横轴截距：斜率：三最适温度、热稳定性和活化能的测定1最适温度测定任何酶反应都有一个最适温度范围。在测定时，只要把其他的反应条件固定，只改变反应温度，通过测定不同温度下的反应速度，以温度为横轴，以酶反应速度为纵轴绘图，就可以得出反应最适温度。如图：

2热稳定性测定时间方法一：在底物浓度、酶浓度、pH等条件不变的条件下，在不同的温度下（一般选用40℃以上的温度），测定相同时间内酶反应速度，计算出不同温度下相对酶反应速度。方法二：在底物浓度、酶浓度、pH等条件不变的条件下，测定在某一较高温度下不同时间的酶反应速度，以反应时间为横坐标，反应速度为纵坐标，绘出曲线。如图3活化能测定斜率=-0.219Ea1/TlgK取对数积分、化为常用对数式中：Ea—活化能K1、K2——分别为温度为T1、T2时测得的酶反应速度常数阿累尼乌斯方程pH值四最适pH值的测定一种酶表现出最高催化活性时的pH值称为该酶的最适pH值。通过测定不同pH条件下酶的催化反应速度，就可以找出其最适pH值。五酶的激活与抑制添加某种物质后，使酶的催化活性增强的现象，称为酶的激活作用。起激活作用的物质称为激活剂。凡是使酶的催化活性减低的现象称为酶的抑制作用。起抑制作用的物质称为抑制剂。酶的抑制作用竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制根据抑制剂[I]与酶[E]的结合方式，可以分成三种酶抑制作用的类型KI—抑制剂的解离常数（mol/l）可以看出，竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值Km的改变，Vmax不受竞争性抑制剂的影响。根据稳态学说竞争性抑制曲线：抑制剂浓度[I]增加时，