小鼠骨关节炎模型中胫骨软骨下骨微结构的Micro-CT分析

小鼠骨关节炎模型中胫骨软骨下骨微结构的Micro-CT分析吉喆;党晓谦;王坤正;周虹CT(Micro-CT)技术观察和分析小鼠骨关节炎模型中软骨下骨微结构的变化,为进一步了解软骨下骨在骨关节炎疾病发展中的作用提供一定128Micro-CT仪器中进行扫描,应用三维重建处理和分析软件对内侧胫骨平台软骨下骨全部及其1/3(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)和组织骨密度(TMD)进行检测,并行膝关节的病,DMMMicro-CTTb.Th1/3BV/TV1/3BV/TV、Tb.ThTMD1/3Tb.Th1/3Tb.Sp1/3Tb.NTb.Sp1/3BV/TVTb.NDMMMicro-CT【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2015(036)005【总页数】6页(P623-627,654)【关键词】Micro-CT;骨关节炎;软骨下骨;骨微结构【作者】吉喆;党晓谦;王坤正;周虹【作者单位】西安交通大学医学部第二附属医院骨科,陕西西安710004;西安交通大学医学部第二附属医院骨科,陕西西安710004;西安交通大学医学部第二附属医院骨科,陕西西安710004;悉尼大学ANZAC研究所,澳大利亚悉尼2139【正文语种】中文【中图分类】R684.3骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种慢性退行性关节疾病，并常有软骨、软骨下骨、滑膜、半月板、韧带、肌腱及关节表面肌肉受累［1］OA多数表现为膝关节的退行病变，临床上患者长期受关节疼痛、肿胀、僵硬及活动OA程中，不仅仅存在着软骨的损伤和修复［2］，同时，也存在关节软骨下骨的结构和功能改变［3-5］。虽然目前尚缺乏足够的证据证明软骨下骨的病变是OA疾病发生的启动因素，但大量的研究不仅证实了软骨下骨的改变是OA疾病发生发展的重要方面，而且软骨下骨微结构与生物力学的改变也可以促使软骨的退变［5-7］。因此，对软骨下骨微结构的研究可以更深层次地认识软骨下骨在OA疾病发生发展过程中的作用。学模型，计算得到骨的各项指标［8］X（computedtomography，CT）Micro-CT重建和骨组织各项参数的定量分析等［9-11］。由于其在骨组织分析中的这些优点，该技术在骨科研究中的应用具有许多不可替代的优势［9-10，12］。本研究Micro-CTOA分析，为进一步研究OA疾病的发展提供更多的理论依据。51250～60。实验动物由悉尼大学动物实验中心提供。小鼠饲养在恒温（21～22℃）SPE（specificpathogenfree）12h（消毒自来水）9∶00～12∶00。实验中对动物的处置符合《澳大利亚关于善待和使用实验动物的科学研究准则》以及中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求。SkyScan1172Micro-CTCTVoxV3.0、DataViewerV1.5.1、CTAnalyserV1.14.426只，即内侧半月板-胫骨韧带切断术组（DMM）和对照组（假手术组）。DMM75g/L10g/L盐酸甲苯噻嗪的生理盐水腹腔注射进行麻醉，仰卧固定，右下肢膝关节及周围备皮、消毒、铺无菌手术巾，于解剖显微镜下行右膝关节髌骨内侧切口，将髌骨翻向外侧，显露内侧半月板-胫骨韧带（图1），镜下切断此韧带，避免损伤关节软骨，通过内侧半月板的被动移位来确认韧带的完全横断［12-13］。复位髌骨，缝合关节囊及皮肤。对照组小鼠给予假手术处理，即显微镜下行右膝关节髌骨内侧表浅皮肤切开后立即关闭切口。术后实验动物分组分笼饲养，不限制其自由活动。术后8周进行以下检测。Micro-CT8（包括全膝关节及邻近股骨远端和胫骨近端），40g/L48h。制备好的全膝Micro-CT59kV167μA16bit295ms，9.18μm，5001000×1000BMPDataViewerV1.5.1CTAnalyserV1.14.4组织分析软件，对全膝关节的Micro-CT扫描图片进行三维图像重建，选取2组小鼠重组图像相同位置的软骨下骨感兴趣区域（regionofinterest，ROI）进行定量分析。具体分析指标如下：骨体积分数（bonevolumefraction，BV/TV）以%表示；骨小梁厚度（trabecularthickness，Tb.Th）以像素值表示；骨小梁数量（trabecularnumber，Tb.N）以1/像素值表示；骨小梁分离度（trabecularseparation，Tb.Sp）以像素值表示；组织骨密度（tissuemineraldensity，TMD）以g/cm3表示。织切片后，进行甲苯胺蓝-固绿溶液组织学染色。统计学方法运用SPSSV22.0软件对实验数据进行两组间比较的独立样本t检验分析，所有数据均采用±s表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。Micro-CTMicro-CT2DMM骨下骨微结构变化（3）：DMM排列较为整齐有序。另外，可观察到实验组内侧胫骨平台软骨下骨的外、中、内3个亚区域微结构变化也存在差异，即内、中部亚区域骨小梁改变较明显，外部亚区域则改变较小，故对小鼠膝关节内侧胫骨平台软骨下骨进行了分区域研究。软骨下骨微结构参数变化BV/TVDMMBV/TV3均有统计学意义，即在外1/3亚区域，实验组为（75.49±1.02）%，显著大于对照组的（69.64±1.85）%（P=0.0197）；1/3（79.44±0.76）%，显著大于对照组的（73.56±1.39）%（P0.0041）；1/31.83）%，显著小于对照组的（73.25±1.06）%（P=0.0058，图4）。Tb.ThDMM1/3Tb.Th（20.71±0.49）%（P=0.0001）；在中1/3亚区域，实验组为（21.23±0.72）%，显著大于对照组的（17.71±0.57）%（P=0.0032）；在内1/3亚区域，实验组为（21.57±0.76）%，显著大于对照组的（18.78±0.62）%（P=0.0173，图4）。Tb.NDMM1/3Tb.N均有统计学意义，即在全部亚区域，实验组为（0.029±0.001）%，显著小于对照组的（0.035±0.001）%（P=0.0005）；1/3（0.038±0.001）%，显著小于对照组的（0.042±0.001）%（P=0.0285）；在内1/3亚区域，实验组为（0.031±0.001）%，显著小于对照组的（0.039±0.001）%（P=0.0002，图4）。Tb.SpDMM1/3Tb.Sp1/3（10.87±0.84）%，显著小于对照组的（14.31±0.72）%（P=0.0110）；1/384）TMDDMMTMD1/3TMD1/30.012）%（P=0.0052）；在中1/3亚区域，实验组为（0.859±0.013）%，显著大于对照组的（0.798±0.018）%（P=0.0217，图4）。甲苯胺蓝-固绿溶液组织学染色结果软骨组织染为深紫蓝色，骨组织染为浅青绿色；DMM（5）较对照组的形骨赘形成（5）。骨基质矿化等多个方面［14］。Micro-CT通过XMicro-CTDMMOA目前有学者认为，软骨下骨结构和功能改变可能是导致OA发病的重要因素之一［7，16-17］。GLASSON等［13］已经证实了DMM诱导的小鼠是可靠的小鼠骨关节炎模型，而且DMM术后8周的小鼠具有早中期骨关节炎病理变化的特征。而IIJIMA等［12］又发现，DMM诱导的大鼠骨关节炎模型内侧胫骨平台软骨下骨在早期即有缺损且被纤维组织填充，并且内侧胫骨平台表面软骨也有不同区域的变化。本实验中DMM小鼠模型膝关节内侧胫骨平台的软骨下骨微结构变化和组织学检查与GLASSON等［13］实验的小鼠模型表型一致，如软骨下骨骨小梁出现增宽、致密等表现并呈现“融合”现象，部分骨小梁排列紊乱不均匀，关节内侧边缘处可见不同程度的椭圆形或圆形骨赘形成等。在本实验Micro-CT的宏观成像图（图2）中，可以大致观察到两组小鼠内侧胫骨Micro-CTBV/TV反映骨组织体积所占总体积的比值，TMD指骨密度或骨矿物质密度，反映骨BV/TVTMDOA软骨下骨骨量和骨矿化水平在内侧胫骨平台的外1/3和中1/3亚区域均明显升高，1/3（或下降趋势），但在全部亚区域均无明显差异。这提示小鼠OA发展的早中期可能存在软骨下骨局部邻近亚区域之间的骨量转移，使总骨量和矿化水平尚能维持不变，而这些变化与骨细胞、成骨细胞、破骨细胞之间的相互作用有关［18-19］。Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp分别指骨小梁的平均厚度、数量和稀疏程度；两组间的这些数据显示：OA小鼠各亚区域（除外1/3亚区域）的骨小梁平均厚度均明显增宽；OA小鼠各亚区域（除外1/3亚区域）的Tb.N均明显减少；OA1/31/3Tb.Th、Tb.NTb.SpOA1/31/3DMMOA（8）内侧胫DMMOA综上所述，应用Micro-CT技术对小鼠DMM骨关节炎模型的胫骨软骨下骨多个OAOA究奠定实验理论基础。【相关文献】［1］LOZITOTP，ALEXANDERPG，LINH，etal.Three-dimensionalosteochondralmicrotissuetomodelpathogenesisofosteoarthritis［J］.StemCellResTher，2013，4Suppl1：S6.［2］杨益民，王民，李萌.氨基胍对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响［J］.学版，2008，29（3）：285-288.［3］ABRAMSONSB，ATTURM.Developmentsinthescientificunderstandingofosteoarthritis［J］.ArthritisResTher，2009，11（3）：227.［4］FELSONDT.Anupdateonthepathogenesisandepidemiologyofosteoarthritis［J］.RadiolClinNorthAm，2004，42（1）：1-9.［5］FELSONDT，NEOGIT.Osteoarthritis：isitadiseaseofcartilageorofbone？［J］.ArthritisRheum，2004，50（2）：341-344.［6］MANSELLJP，COLLINSC，BAILEYAJ.Bone，notcartilage，shouldbethemajorfocusinosteoarthritis［J］.NatClinPractRheumatol，2007，3（6）：306-307.［7］ZAMLIZ，ROBSONBK，TARLTONJF，etal.Subchondralboneplatethickeningprecedeschondrocyteapoptosisandcartilagedegradationinspontaneousanimalmodelsofosteoarthritis［J］.BiomedResInt，2014，2014：606870.［8］WANGX，ZAUELRR，RAODS，etal.Cancellousbonelamellaestronglyaffectmicrocrackpropagationandapparentmechanicalproperties：separationofpatientswithosteoporoticfracturefromnormalcontrolsusinga2Dnonlinearfiniteelementmethod（biomechanicalstereology）［J］.Bone，2008，42（6）：1184-1192.［9］GIELKENSPF，SCHORTINGHUISJ，DEJONGJR，etal.Acomparisonofmicro-CT，microradiographyandhistomorphometryinboneresearch［J］.ArchOra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