玉铃花种子生物学特性研究材料与方法,园艺学论文

玉铃花种子生物学特性研究材料与方法,园艺学论文【题目】【1.1】【1.2】【第二章】玉铃花种子生物学特性研究材料与方式方法【第三章】【第四章】【结论/以下为参考文献】2.材料与方式方法2.1实验材料实验用玉铃花种子采自河南，在成年玉铃花树上采集果实，经晾晒揉搓得到种子，去杂备用。测种子生活力种子为大白菜种子。2.2实验设计与研究方式方法2.2.1种子生物学特性研究2.2.1.1种子的形态特征随机抽取50粒玉铃花种子，观察其形状、颜色、质感、光滑度等方面，总结种子的形态特征。用游标卡尺测定种子的横轴直径〔W〕、纵轴直径〔L〕、种子厚度，计算其平均值。采用千粒法测定玉铃花种子的千粒重，采用四分法随机抽取1000粒种子为一组，共取3组，分别用1/1000天平称重,读数精到准确到小数点后两位，计算三个数的平均值即为种子的千粒重。2.2.1.2种子的含水量采用105℃烘箱法测定玉铃花种子中自由水的含量。测定时，取适量玉铃花种子，精到准确称重〔W1〕后，于80℃恒温枯燥箱内预烘2-3h,然后于105士2℃烘至重量不再变化，冷却后称重〔W2〕，则种子相对含水量的计算公式为：相对含水量〔RWC〕=〔W1-W2〕/W12.2.1.3种子生活力测定采用TTC染色法快速测定种子生活力。随机选取种子，设置3个重复，每个重复取50粒种子。将待测种子用水浸泡24h,待种子充分吸胀后，用单面刀片沿胚乳〔胚〕的中线纵切成均等的两半，将华而不实一半放在培养皿中，参加适量的0.5%TTC溶液，以淹没种子为标准，将另一半在沸水中煮5min杀死胚，然后置于40℃染色6h,用自来水反复冲洗种子，直至所染颜色不再洗出为止，观察种子胚部的染色情况，算出具有生活力的种子百分率。对玉铃花种子生活力测定的判读根据下面标准：○1有生活力种子：胚和胚乳全部正常染色；胚全部被染色，胚乳少量未染色。○2无生活力种子：胚和胚乳全部未染色；胚全部染色，胚乳未染色；胚未染色，胚乳大部分染色。2.2.2种子休眠原因2.2.2.1种子透水性测定通过绘制种子吸水曲线图测定种子透水性。分别随机抽取完好种子、破皮种子〔将种皮敲出一条裂缝〕各50粒，称重后放在25℃的恒温培养箱中，用去离子水浸泡种子。每隔两小时取出种子〔12h后，每12h取一次〕，用吸水纸吸干种子外表的水分，在1/1000电子天平上称重，直至种子重量不再变化为止。每处理设置3个重复，计算其吸水率。吸水率〔%〕=〔吸水后质量〔g〕-吸水前质量〔g〕〕/吸水前质量〔g〕100%2.2.2.2种子各部分萌发抑制物的生物测定取饱满玉铃花种子，将种皮和胚乳〔含胚〕分开后，分别称取2.5g,用液氮迅速冷冻，用5ml80%的甲醇研磨，将研磨液分别倒入100ml锥形瓶中，再各用80%甲醇屡次清洗16研钵，将研磨液与清洗液合并，倒入同一锥形瓶中，最后以80%甲醇分别定容至50ml,摇匀后,用封口膜封口，放入4℃震荡培养箱中浸提，,浸提48小时后取出，在4℃6000rpm条件下离心1min,离心后将上清液倒入150ml锥形瓶中，沉淀再以80%甲醇定容至50ml浸提，用震荡仪振荡搅拌，至充分混合，4℃条件下再次离心，操作同上，分别合并两次离心的上清液于，锥形瓶中，用真空旋转蒸发仪，设置转速80r/min,水域温度为40℃，减压旋转蒸发掉甲醇，直至剩余全部为水相，用蒸馏水定容至40ml,即得玉铃花种皮与胚乳中内源抑制物质的浸提液原液。将浸提液原液分别稀释，稀释浓度分别为原液浓度的20%、40%、60%、80%、100%〔20%浸提液既将浸提液原液稀释为原浓度的20%的溶液，40%、60%、80%、100%浸提液稀释原理同上〕。在上述提取液中各放白菜籽50粒，浸泡两小时。在培养皿中放两层滤纸，分别取各浓度的提取液2ml浸湿滤纸，将各浓度浸泡的白菜籽放入培养皿中，后分别取各对应浓度的浸提液5ml,对白菜籽进行抑制物活性测定，以同体积的蒸馏水作为对照，每个处理三个重复。在培养箱中，进行白菜籽发芽试验，48h统计白菜籽发芽率〔以露出子叶为发芽标准〕，72h测其苗高和根长。本实验所用的白菜籽为北京益丰惠农农业科技研究所的四季小白菜，纯度95.0%,净度98.0%,发芽率85%,含水量约为8.0%.2.2.3层积经过中种子生理生化变化的研究本实验采用低温层积，层积前经0.3%高锰酸钾消毒30min后，用30-40℃温水浸泡24h,将沙子与种子以3:1的比例混匀〔层积所用沙含水量保持在60%左右〕，后装入容器中，埋藏深度约50cm,宽70cm,后培土，顶部构成丘状即可，从沙藏开场每隔30天取种一次，分别测定种子的含水量，可溶性糖、淀粉、蛋白质含量以及淀粉酶活性变化。层积历时5个月，总共150天。2.2.3.1含水量测定取层积中的种子，用水冲洗干净外表的沙粒，然后用滤纸吸干外表的水滴，称取每20粒种子为一组，重复三次，记录重量〔精到准确到小数点后第三位〕。将称量瓶预先烘至恒重并编号，把三份测定样品分别装入对应的称量瓶中，并记下称量瓶重和瓶号。然后称量，记下读数。将称量瓶放入烘箱中，敞开盖子，从温度回升到105℃时开场计时，连烘8h.取出后盖上盖子，放入枯燥器中冷却15-20min.取出称重，记录读数。再敞开盖用105℃烘2h,再按上法称重，记下读数。直到前后两次的重量之差小于0.01g时，即以为已到达恒重，种子干重即为恒重时的重量。种子含水率的计算：根据测定结果，按下式分别计算3份测定样品的相对含水量百分率，精度到小数点后一位。种子含水率〔%〕=〔测定样品烘干前重-测定样品烘干干重〕/测定样品烘干前重2.2.3.2可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法测定可溶性糖和淀粉含量。详细操作如下：称取1.0g种子，放入25ml试管中，加沸水25mL,放在水浴锅中加盖煮沸10min,放置冷却后过滤在50mL的容量瓶中，加水定容，便为可溶性糖的提取液。用移液枪汲取提取液0.5mL于大试管中，参加蒸馏水1.5mL,2%蒽酮试剂0.5mL,再参加浓硫酸5mL,摇匀，静置10min,在620nm波长下比色，记录吸光度，在标准曲线上查出对应的葡萄糖的含量。再按以下公式进行计算，得出样品中可溶性糖的含量。设定3个重复。种子样品含糖量〔mg/g〕=[查表所得的糖量〔mg〕样品稀释倍数]/样品重〔g〕2.2.3.3可溶性淀粉含量测定在提取可溶性糖后剩余的枯燥残渣中加20mL蒸馏水，放入沸水浴中煮沸15min,再参加2mL9.2mol/L高氯酸溶液，提取15min,冷却后过滤，定容，摇匀。汲取滤液0.5mL于大试管中，加蒸馏水1.5mL,2%蒽酮试剂0.5mL,再参加浓硫酸5mL,微微摇动，当管内出现葱酮絮状物时，再剧烈摇动促进葱酮溶解，然后立即放入沸水浴中加热10min,冷却后在620nm波长下比色，记录吸光度。在标准曲线上查出对应的淀粉含量，再按以下公式进行计算。每个样品设定3个重复。样品淀粉含量〔mg/g〕：[查表所得的淀粉含量〔mg〕样品稀释倍数]/样品重〔g〕2.2.3.4可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量，详细操作如下：称取1.0g种子，加4mL蒸馏水，使用FS-2型可调高速分散器研磨成匀浆，转移到离心管中，再用4mL蒸馏水洗涤，一并转入离心管中，然后在10000r/min下离心30min,过滤，取提0.1mL取液于试管中，然后参加G-250溶液5mL,充分混合，放置2min后在595nm下测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。设定3个重复。样品淀粉含量〔mg/g〕：[查表所得的淀粉含量〔mg〕样品稀释倍数]/样品重〔g〕18洗涤，一并转入离心管中，然后在10000r/min下离心30min,过滤，取提0.1mL取液于试管中，然后参加G-250溶液5mL,充分混合，放置2min后在595nm下测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。设定3个重复。样品中蛋白质含量=〔CVT〕/〔VSWF〕[mg/g]C为查标准曲线值，mg;VT为提取液总体积，mL;Vs为测定时参加的提取液的量，mL;WF为样品的鲜重，g2.2.3.5淀粉酶含量测定淀粉酶活性测定采用李合生的方式方法，详细操作如下：称取1g左右的种子，参加4mL的蒸馏水，用FS-2型可调高速分散器研磨成匀浆，再用4mL蒸馏清洗研钵，混均后将提取液在室温下〔25℃〕放置提取15-20min,每隔几分钟搅动一次，使其充分提取。然后在温度为0-4℃转速为10000r/min条件下离心30min,过滤后即为淀粉酶原液备用。-淀粉阵活性的侧定：取3支试管〔1支为对照管，2支为测定管〕，在各管中加lmL酶提取液，在70℃恒温水浴中准确加热15min,取出后迅速在自来水中冷却，再向对照管中参加2mL的3,5-二硝基水杨酸试剂。然后将试管都置于40℃士0.5℃恒温水浴中预保温10min,再向各管中分别参加40℃下预热的1%淀粉溶液1mL,摇匀后，立即放入40℃士0.5℃水浴中准确保温5min后取出，向各测定管迅速参加2mL的3,5-二硝基水杨酸试剂，以终止酶的活性。摇匀，各试管置于沸水浴中5min,取出后冷却，加10mL蒸馏水。摇匀，在540nm波长下比色，测定吸光度。+-淀粉酶活性的侧定：取3支试管〔1支为对照管，2支为测定管〕，向每管中加lmL酶提取液，再向对照管中参加2mL的3,5-二硝基水杨酸试剂。然后将测定管和对照管置于40℃士0.5℃恒温水浴中保温10min,再向各管中分别参加1mL40℃下预热的1%淀粉溶液，摇匀后，立即放入40℃士0.5℃水浴中准确保温5min