发酵工程菌种的来源

发酵工程菌种的来源第一页，共六十七页，2022年，8月28日

教学目的：了解工业化菌种的要求以及一些工业化生产菌介绍；了解菌种分离的一般过程；掌握土样采集应注意的问题，菌种的分离方法；掌握优良菌种应具备的基本特性和菌种的选育、种子扩大培养。

教学重点、难点：土样采集应注意不同的土壤特点、地理和气候条件，土样的采集方法；生化反应分离法；种子扩大培养。

第二章菌种的来源(4学时)第二页，共六十七页，2022年，8月28日

内容速览2诱变育种2.2目的微生物的分离2.1工业化菌种的要求及介绍2.3菌种选育1自然选育菌种的来源2.4种子扩大培养第三页，共六十七页，2022年，8月28日一、工业化菌种的要求

§1工业化菌种的要求及已工业化产品生产菌介绍能在廉价原料制成的培养基上生长，且大量高效地合成产物；

遗传性能要相对稳定；

菌种改造的可操作性要强；

抗噬菌体及杂菌污染能力强；

产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；

发酵条件如温度、pH、溶解氧、泡沫等易控制。第四页，共六十七页，2022年，8月28日放线菌（链霉素、四环素、红霉素等）真菌（青霉素、头孢菌素等）一些产芽孢的细菌（多黏菌素、丁胺菌素等）植物或动物来源（蒜素、番茄素、鱼素等）1、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：二、已工业化产品生产菌介绍第五页，共六十七页，2022年，8月28日初级代谢和次级代谢异同？1概念不同2产物不同3存在范围不同4对微生物的作用不同5同微生物生长过程的关系6对环境条件的敏感性或遗传稳定性上明显不同7相关酶的专一性不同8两者既有区别性又有连续性第六页，共六十七页，2022年，8月28日概念不同

在微生物的新陈代谢中，一般将微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程，称为初级代谢而次级代谢是相对于初级代谢而提出的一个概念。一般认为，次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程第七页，共六十七页，2022年，8月28日产物不同

初级代谢的产物，即为初级代谢产物。如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等生命必需物质。<通过次级代谢合成的产物称为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型第八页，共六十七页，2022年，8月28日存在范围不同

初级代谢的代谢系统、代谢途径和代谢产物在各类生物中都基本相同，它是一类普遍存在于各类微生物中的一种基本代谢类型。<次级代谢只存在于某些微生物中，并且代谢途径和代谢产物因生物不同而不同，就是同种生物也会由于培养条件不同而产生不同的次级代谢产物。

第九页，共六十七页，2022年，8月28日对微生物的作用不同

通过初级代谢，能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，因此初级代谢产物，通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止，重则导致机体发生突变或死亡，是一种基本代谢类型。次级代谢产物一般对菌体自身的生命活动无明确功能，不参与细胞结构组成，也不是酶活性必需的，不是机体生长与繁殖所必需的物质，即使在次级代谢的某个环节上发生障碍，也不会导致机体生长的停止或死亡，至多只是影响机体合成某种次级代谢产物的能力。但许多次级代谢产物通常对人类和国民经济的发展有重大影响第十页，共六十七页，2022年，8月28日2、氨基酸生产有关的微生物

用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。

50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点。代谢控制发酵第十一页，共六十七页，2022年，8月28日可以大量积累人工诱变的菌株不能合成反馈抑制不能合成人工诱变控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸P459高丝氨酸脱氢酶第十二页，共六十七页，2022年，8月28日氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚；代谢途径比较简单。谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌。常规菌种一般是以谷氨酸生产菌选育而成；大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，工程菌。第十三页，共六十七页，2022年，8月28日3、酶制剂生产有关的微生物

利用微生物来进行酶制剂生产是19世纪日本人用曲霉通过固体培养生产他卡淀粉酶，而大规模工业化生产则始于20世纪40年代末日本用深层发酵法生产α—淀粉酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等；β-淀粉酶：米曲霉、巨大芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌等；纤维素酶：木霉、青霉；蛋白酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌等。

返回第十四页，共六十七页，2022年，8月28日

一、菌种分离的一般过程

二、微生物材料的标本采集

A、不同的土壤特点

B、地理和气候条件

C、微生物的生理特性

D、极端环境条件下采样分离

三、标本的预处理

四、目的微生物富集的一些基本方法

五、菌种分离§2自然界中目的微生物的分离第十五页，共六十七页，2022年，8月28日2023/1/2315一、菌种分离的一般过程P14标本采集→预处理→富集培养→菌种分离（初筛、复筛）→发酵性能鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大？如何在后续的操作中使这种可能性实现？目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：→菌种保藏

返回第十六页，共六十七页，2022年，8月28日遵循原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种一般通过以下途径获得菌种：①向菌种保藏机构索取有关菌株；②由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等；③从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌。二、微生物材料的标本采集第十七页，共六十七页，2022年，8月28日国内菌种保藏机构27ACCC中国农业微生物菌种保藏管理中心ISF中国农业科学院土壤肥料研究所SH上海市农业科学院食用菌研究所CACC抗菌素菌种保藏管理中心IA中国医学科学院抗菌素研究所SIA四川抗菌素工业研究所CGMCC普通微生物菌种保藏管理中心AS中国科学院微生物研究所AS-IV中国科学院武汉病毒研究所CFCC林业微生物菌种保藏管理中心CAF中国林业科学院菌种保藏管理中心CICC工业微生物菌种保藏管理中心IFFI轻工业部食品发酵工业科学研究所CMCC医学微生物菌种保藏管理中心ID中国医学科学院皮肤病研究所NICPB卫生部药品生物制品监察所IV中国医学科学院病毒研究所CVCC兽医微生物菌种保藏管理中心CIVBP中国兽医药品监察所YM云南省微生物研究所GIMCC广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心CCTCC中国典型培养物保藏中心CCDM华中农业大学菌种保藏中心CMBGCAS海洋微生物中心HKUCC香港大学保藏中心CUHK香港中文大学保藏中心BCRC台湾生物资源保藏研究中心，台湾新竹第十八页，共六十七页，2022年，8月28日国外菌种保藏机构ATCC(AmericanTypeCultureCollection）美国典型菌种保藏中心NBRC(NITEBiologicalResourceCenter)日本技术评价研究所生物资源中心NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)美国农业研究菌种保藏中心CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures)荷兰微生物菌种保藏中心UKNCC(TheUnitedKingdomNationalCultureCollection)英国国家菌种保藏中心第十九页，共六十七页，2022年，8月28日

自然界中微生物极其丰富，土壤是微生物最集中的地方，所以土壤样品往往是采集的首选目标。土样采集应注意以下问题：

A、不同的土壤特点

B、地理和气候条件

C、微生物的生理特性

D、极端环境条件下采样分离二、微生物材料的标本采集第二十页，共六十七页，2022年，8月28日A、不同的土壤特点P15

因土壤组成、有机物浓度、pH等条件的不同，微生物的种群分布会非常不同。如菜园和农田常以细菌和放线菌较多（偏碱）；果园树根土壤中酵母菌含量较高（偏酸）；动植物残骸及腐殖土中霉菌较多；根瘤菌多在豆科植物根系土壤中分离；分解石油的微生物常在油田和石油炼油厂附近的土层中分布最多。

自然环境中的天然菌群，可因人类的生产或生活而改变。如在土壤中加去莠津（2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪），会导致放线菌群的增加；在杀真菌剂存在下，诺卡氏菌属的菌更容易分离到。第二十一页，共六十七页，2022年，8月28日B、地理和气候条件

南方和北方，一年四季。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方。原因是南方温度高、温暖季节长、雨水多、相对湿度高、植被覆盖面广、土壤有机质丰富。冬季温度低气候干燥；春季温度开始回升但雨水较多；夏季天气炎热温度高；秋季采土样最为理想。

采土样的方法：南方，用取样铲，将表层5cm（阳光直射，蒸发量大水分少，而且受紫外线照射）左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。

第二十二页，共六十七页，2022年，8月28日C、微生物的生理特性

筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；

低温酶产生菌时，南北极地区、冰窑、深海；分离耐压菌则从深海底部采样，如Micrococcusaquivivus水活微球菌,耐600个大气压；分离耐高渗透压酵母菌时，通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌。第二十三页，共六十七页，2022年，8月28日Ｄ、极端环境条件下采样分离

极端微生物的采集。高热、高压、低温、强碱、强酸及高渗透压等

返回第二十四页，共六十七页，2022年，8月28日三、标本的预处理

提高菌种分离的效率●物理方法：加热(55℃,6min；100℃,1h；40℃2-6h)、膜过滤法、离心法、空气搅拌法●化学方法：含1%几丁质培养基、用CaCO3提高pH值进行培养（链霉菌属）●诱饵法：用涂石蜡的棒置于碳源培养基中（诺卡氏菌）、花粉（游动放线菌）、蛇皮（小瓶菌属）、人头发（角质菌属）第二十五页，共六十七页，2022年，8月28日小瓶菌属

放线菌目、游动放线菌科的一属。已记述约10个种。代表种为规则小瓶菌。形态特征：一般无气生菌丝，基内菌丝上层栅栏状菌丝或孢囊柄顶端着生瓶状、简形、铃状或略不规则的孢囊，其中有大量呈平行直线排列的杆状孢囊孢子；孢囊孢子大部具极生鞭毛，能游动；细胞壁化学组分Ⅱ型，即以内消旋二氨基庚二酸和甘氨酸为特征组分

；DNA中的G+C克分子含量为72.3％。

返回第二十六页，共六十七页，2022年，8月28日富集的基本方法：

1、控制营养：如以唯一碳源或氮源作底物；

2、控制培养条件：如pH、温度、通气量等；

3、抑制不需要的种类。四、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。

富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基或创造有利生长条件，使目的微生物数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所需要的菌株。第二十七页，共六十七页，2022年，8月28日富集培养方法：

1、分批式富集培养：指将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此重复几次后，再取此富集培养物接种至固体培养基上，以获得单菌落。转种是关键。

2、恒化式富集培养：通过改变限制性基质浓度，来控制两类不同菌株的比生长速率。四、目的微生物富集的一些基本方法

返回第二十八页，共六十七页，2022年，8月28日五、菌种分离

从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基；利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素。

从形态的角度

菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。第二十九页，共六十七页，2022年，8月28日1、常规分离法：平板划线法、稀释分离法和涂布法2、生化反应分离法：透明圈法、变色圈法、抑菌圈法、生长圈法。

透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，这样能分解该底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈。

圈的大小可初步反映该菌株利用底物的能力，完全可以作为菌种初筛的判断标准。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及核酸酶产生菌的分离，产有机酸菌的初筛。第三十页，共六十七页，2022年，8月28日第三十一页，共六十七页，2022年，8月28日A分区划线法B连续划线法

返回第三十二页，共六十七页，2022年，8月28日

将样品分散到最低浓度

倒平板，培养，挑取单菌落

后面3个稀释度各取0.1ml涂布

返回第三十三页，共六十七页，2022年，8月28日33

返回第三十四页，共六十七页，2022年，8月28日例1：分离某种产生有机酸的菌株时，在培养基中添加碳酸钙。例2：分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为唯一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。第三十五页，共六十七页，2022年，8月28日

例1：分离果胶酶产生菌，用含0.2%果胶为唯一碳源，菌落长成后加入0.2%的刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现降红色的变色圈。例2：分离内肽酶产生菌，除了用酪蛋白作底物平板产生透明圈进行鉴别外，还可用吲羟乙酸酯为底物加到分离培养基内，产生蛋白酶的菌落由于水解吲羟乙酸酯为3-羟基吲哚，后者能氧化生成蓝色产物，根据变色圈便可选出平板上产蛋白酶菌株。

变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。第三十六页，共六十七页，2022年，8月28日

抑菌圈法：若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落的周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，被鉴别出来。抑菌圈自动测量分析仪

第三十七页，共六十七页，2022年，8月28日

常用于抗生素产生菌的分离。工具菌的选择是关键，工具菌采用抗生素的敏感菌。传统上常用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌作为工具菌检验抗生素的抗性，现采用联合工具菌如枯草芽孢杆菌和绿色产色链霉菌或巴氏梭状芽孢杆菌，可分离出抗菌活性低，对其它试验菌活性高的新抗生素，如黄色霉素族的抗生素，而这些抗生素在单独使用枯草芽孢杆菌作工具菌时无法检出。第三十八页，共六十七页，2022年，8月28日

如，嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品进行保温培养，周围出现生长圈的菌落即为

。嘌呤产生菌

生长圈法：常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等产生菌。其工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株，由于得到所需的营养，凡是目的微生物周围便会出现一个混浊生长圈。

返回第三十九页，共六十七页，2022年，8月28日§3菌种选育目的：

防止菌种退化

解决生产实际问题提高生产能力

提高产品质量开发新产品第四十页，共六十七页，2022年，8月28日

（1）菌种细胞的生长活力强；（2）生理性状稳定；（3）纯、具有抗噬菌体感染的能力；

（4）稳定高产，与目标产品性质相近的副产物及其他产物少；

（5）能采用价格便宜，来源广泛的原料，并且转化效率高。方法：自然选育、诱变育种、细胞工程育种（杂交育种、原生质体融合育种）、基因工程育种等。优良的生产菌种应具备的基本特性

返回第四十一页，共六十七页，2022年，8月28日自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9自然突变有两种情况：

一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。一、自然选育定义：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。第四十二页，共六十七页，2022年，8月28日自然突变引起的原因多因素低剂量的诱变效应：指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质的作用引起的突变。互变异构效应：指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。T、G：酮式或烯醇式

C、A:氨基式或亚氨基式。

平衡：倾向于酮式或氨基式第四十三页，共六十七页，2022年，8月28日自然选育在工业生产上的意义

意义：自然选育是一种简单易行的方法，可达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。虽然其突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变。问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？第四十四页，共六十七页，2022年，8月28日自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验第四十五页，共六十七页，2022年，8月28日自然选育方法通过表现形态来淘汰不良菌株；（初筛）

通过目的代谢产物产量的考察；（复筛）进行遗传基因型纯度试验；传代稳定性试验。第四十六页，共六十七页，2022年，8月28日自然选育方法通过表现形态来淘汰不良菌株；（初筛）

菌落大小、生长速度、颜色、孢子的形成。用于特征明显的微生物如丝状真菌、放线菌及部分细菌。第四十七页，共六十七页，2022年，8月28日例：抗生素菌种选育一般低产菌的菌落不产生菌丝，菌落多光秃型；生长缓慢，菌落过小，产孢子少；孢子生长及孢子颜色不均匀，产生白斑、秃斑或角变；或生长过于旺盛，菌落大，孢子过于丰富等。判断高产菌落则根据：孢子生长有减弱的趋势，菌落中等大小，菌落偏小但孢子生长丰富，孢子颜色有变浅的趋势，菌落表面沟纹整齐，多、密且较直；分泌色素或逐渐变浅。第四十八页，共六十七页，2022年，8月28日自然选育方法通过目的代谢产物产量的考察；（复筛）高产菌落摇瓶复筛，考察菌种生产能力的稳定性和传代的稳定性。复筛条件已较接近发酵生产工艺。复筛的菌种应及时进行保藏。厌氧微生物厌氧培养基静置培养。第四十九页，共六十七页，2022年，8月28日自然选育方法进行遗传基因型纯度试验；分离、表观形态进行考察，相似的主要菌落占90%以上。传代稳定性试验。斜面传代3~5次（代）的连续传代，产量保持稳定的菌种用于生产。条件一致。

返回第五十页，共六十七页，2022年，8月28日二、诱变育种P55

人工利用各种诱变剂诱发基因突变，再通过适当的筛选方法获得所需要的优良菌种的育种方法，称为诱变育种。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂

表2-1物理的：紫外线、快中子、x射线等化学的：硫酸二乙酯、亚硝基胍、Y啶类物质等{生物的：噬菌体、转座子诱变育种的理论基础是：基因突变？

●紫外线使用时间较久，辐射光源便宜，危险性小，诱变效果好应用最广泛，研究最多。波长260nm左右(253~265)诱变效果最好。

●激光和微波作为诱变剂，尚处于摸索阶段。基因重组？第五十一页，共六十七页，2022年，8月28日化学诱变剂烷化剂：芥子气（SM）氮芥(NM)，环氧乙烷(EO)，二环氧丁烷（DEB），硫酸二乙酯（DES），甲基磺酸乙酯（EMS），乙基磺酸乙酯(EES)、乙烯亚胺(EL)，三亚乙基三聚氰胺(TEM)，-丙酸内酯，重氮甲烷,N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、二乙基亚硝基胺(DEN)嵌合剂（移码诱变剂）：吖啶橙、吖啶黄碱基类似物：5-FU，5-BU脱氨基诱变剂：亚硝酸第五十二页，共六十七页，2022年，8月28日（一）诱变剂处理过程中几个有关的问题

1、化学诱变剂使用过程的安全性2、出发菌株的选择3、诱变剂的选择4、诱变剂量的选择第五十三页，共六十七页，2022年，8月28日化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防上污染环境，造成公害。1、化学诱变剂使用过程的安全性第五十四页，共六十七页，2022年，8月28日NTG(亚硝基胍）是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例用自来水大量冲洗或用1-2N的NaOH浸泡过夜，洗净。EMS（甲基硫酸乙酯）是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10％NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。1、化学诱变剂使用过程的安全性第五十五页，共六十七页，2022年，8月28日

定义：出发菌株指用于诱变育种的最初菌株或每代诱变的试验菌株。★对菌株产量，形态、生理等情况了解；★生长繁殖快，营养要求低，产孢子多且早；★对诱变剂敏感；★菌株要有一定的生产能力；★多出发菌株：一般采用3~4个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。选择出发菌株的要求：2、出发菌株的选择第五十六页，共六十七页，2022年，8月28日出发菌株及生理状态：真菌、酵母106个/ml，放线菌孢子106~107个/ml,细菌108个/ml，细菌选择对数生长期，真菌和放线菌使用幼年孢子，芽孢细菌也可以用芽孢进行诱变处理。力求90%以上为单孢子，制菌悬液用生理盐水或缓冲溶液。2、出发菌株的选择第五十七页，共六十七页，2022年，8月28日3、诱变剂的选择●考虑诱变剂的作用机理，根据实际操作方便或成功的经验；●实践证明并非所有诱变剂对某个出发菌株都是有效的；●诱变剂的诱变作用，还取决于出发菌株的特性及其诱变史。诱变剂作用细胞后，对DNA作用引起突变，但不一定都能形成突变体，原因是菌体为了生存，具有一套自我修复系统。第五十八页，共六十七页，2022年，8月28日4、诱变剂量的选择

剂量的大小常以致死率和诱变率来确定。最适剂量是指能够提高正突变株变异频率幅度的诱变剂量。处理剂量大，致死率高，诱变率也会提高，但达到一定程度后，再提高剂量反而会下降；但诱变剂量也不宜过低，否则很难获得所需的正突变株。致死率90%~99.9%（过去）70%~80%（现在）。

第五十九页，共六十七页，2022年，8月28日（二）诱变剂处理的方式（1）直接处理：将菌悬液用诱变剂直接处理，然后分离。（2）生长过程处理：适用于诱变作用强而致死率低的诱变剂，或只在分裂过程中对DNA起作用的诱变剂，如秋水仙素。这些诱变剂一般都直接加入到培养基中，混匀，倒入平皿制成平板后培养，在生长过程中诱发菌体突变。（3）振荡培养处理：即在摇瓶培养基中加入一定量的诱变剂。菌体随着振荡培养，不断地和诱变剂接触，它们之间的作用远比平板生长过程处理充分得多，所以诱变剂浓度不宜过高。第六十页，共六十七页，2022年，8月28日（三）诱变筛选流程

(致死率、突变率、正变率、高产率、投产率)出发菌种斜面

或摇瓶培养24h细菌悬液

稀释涂平板单孢子悬液

诱变处理挑取单菌落200个

摇