生物化学-第4讲dna复制

链

DNA的化学合①链增 封3’→5’3’→5’不需要模

缩④⑤1λmax= U

核酸的紫外吸收光温CTDNA:A260/A280=1.8RNA:A260/A280=

增色效应：核酸变性减色效应：核酸复性，消光系2上节回 核酸的分离纯CsCl超速离 电泳分电泳可分离不同长度 PAGE和琼脂糖凝胶3上节回 “序列–片段长度–迁移率待测DNA作模需要DNA聚合酶以四种dNTP为原在引物作用下合 4例如

核酸内DNA连接5 蛋白核酸的核酸研究的化学RNA转录与加蛋白质核苷酸分解代谢及生物6核酸生物第四DNA课后阅读第30第2Lehninger第257E.图8一、 的基本原半保原

Meselson-Stahl实 9从起点开始双叉

利用denaturation发现存 原点单 ：一 叉单向移动。如某些环状DNA相 ：从两个起点起始，两 叉各以一条为模板相 。如 半不连 (5’→3’方向叉移动片段(1968年

滞后

前导 DNA的前导链以5’→3’方向连续滞后链的合成不连续，且相反 叉前进方向原核生 片段约1000nt；真核生物约200nt二、 的化学反DNA聚合ArthurDNA聚合酶

模板(dNMP)n+ (dNMP)n+1+利用dNTP为底物，需要金属离子以DNA为模板DNA聚合酶可以甄别正确底配配才能被酶催化进行聚合反应，该校对作用保证了入核苷酸的错误率仅为10-5 发现错后只作用于DNA3’末端的错配 切苷酸，不作用于双链DNA正常生长的链，只有出现错配时，生长链的3’末端才会落入3’→5’外切，使错配碱基立即被清除 聚合酶链反应PCR(polymerasechainreaction)可实现体外快速 或DNA序列。1985年，K.Mullis提没 叉怎么办？将DNA变性，使双链分开Kary(1944~至今

所需材引物、金属离子(Mg2+) PCR(polymerasechain三、原核 的分子机原核生物DNA37℃时的催化速率：1000dNTP/min/每分多聚合酶活性（催化链沿5’→3’方向延长）功3’→5’核酸外切酶活性（具有核对功能）能5’→3’核酸外切酶活性(作用于双链）酶从3’端使DNA链发生焦磷酸解（逆反应焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基DNA聚合酶Ⅰ催化的聚合反应合成速度是细胞内 速度的持续合成能力低（细胞内 并不频繁中断 DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ 年5’→3’合成，引物为小缺口的双链具3’→5’外切酶活酶活性只有聚合酶Ⅰ的DNA聚合酶 缺陷的变异株，细胞生速度正推断：DNA聚合酶Ⅰ和聚合酶II均不是真正 DNA聚合酶III(1971年具有5’→3’聚合和3’→5’活性高达大肠杆菌 的主导聚合

DNA聚合酶IIIDNA

DNA装配 滑动DNA，同源六聚体，是体央孔洞直径约3.5nm能， 的起大肠杆 原点

ssDNA结合 13bp保守序

9bp保守序列，DnaA

解旋 在完在完合成双+

四聚体形式，单 生 生 张单链结解链酶DnaB六聚DnaC

起始复3×13bp序列变RNA疑问：聚合酶只能延长已有的DNA如何开始？滞后链上片段的合成如 引物合成方向：5’→3’，与DNA催化引物合成的酶：引物合成 连接酶： 的延①②③前导前导链和滞后链的合成同时前导 RNA10－60

引物合(RNA聚合酶DNA聚合酶持续合

10个核苷5’-3’合片5’-3’外切5’-3’聚合

体不断成RNA引DNA聚合酶DNA聚合I引物间 细菌：1000-

DNA连接真核细胞：100-

DNA连接酶(DNAligase,基团和3OH共价连接生成腺苷的原核 机去除引连接1800 是一个高保真系统(E.coli错配率:10-9-10-10)－DNA聚合酶具有选择正确碱基的能－DNA聚合酶具有自我核对功（链延长前识别末端碱基－消除RNA大，为保证忠实性，必须删除任何不确连续运转的原核 机①连续运转的原核 机②连续运转的原核 机③连续运转的原核 机④连续运转的原核 机⑤4. 的终 制叉，释四、真核 的分子机组更DNA与组蛋白速度比原核生物细菌 叉移动：50哺乳类动物DNA：1-3人类DNA每30-300Kb有一 起始位每条染色质上有多 起始子小，40- 时间基本相完成前，各起点不再开始新原核生物可在原点连续发 （多 叉真核生物DNA聚合真核生物DNA聚合酶的特性比性αβγδε4122-细胞内分核核线粒核核功DNA引合损伤修线粒修3’→5’无无有有有5’→3’无无无无无DNA聚合酶共同具有的性质：需模板，引物激活，dNTP为底物，链延伸方向为区别：真核生物DNA聚合酶可以没有外切 DNA聚合酶α有引物合成酶活性，即起始前导链和 DNADNA聚合酶β活性水平稳定，主要在损伤修复中起DNA聚合酶γ是线粒体DNA的合成酶 DNA聚合酶δ有3’→5’外切酶 DNA聚合酶ε与滞后链合成有关，是具有校对功能DNA聚合酶ε与滞后链合成有关，是具有校对功能真核生物DNA 机负责延伸前导

DNA聚合酶DNA聚合酶

前导 叉

复合酶负责合成滞后 DNA聚合酶δ或链 片

DNA聚合酶去除RNA

在连接

RNA降解

FEN1蛋白（5’→3’外切酶活 端粒结DNA 切掉的引物端逐步缩子代链 3端逐步缩

子链DNA短于 人的端粒端 端

富含富含成串的短的重复序端粒结构的缩短可通过端粒酶外加重复单位补足端粒酶：逆转录酶，分子内含一条约有150个碱基RNA链和1.5个拷贝的端粒重复单合成端粒