发育毒性及其评价

发育毒性及其评价第一页，共九十三页，2022年，8月28日目的与要求：1.掌握基本概念2.掌握Wilson发育毒理学基本原理3.了解发育毒性的作用机制4.熟悉发育毒性的评价第二页，共九十三页，2022年，8月28日第一节概述第三页，共九十三页，2022年，8月28日生殖与发育生殖是对亲代动物而言，从配子生成、受精到胎体分娩是一生殖过程。发育主要是对子代而言，从受精卵到性成熟的青春期甚至一直到衰老都属于发育过程。第四页，共九十三页，2022年，8月28日发育毒理学的发展简史畸胎学（古代）现代实验畸胎学（19世纪）发育毒理学第五页，共九十三页，2022年，8月28日畸胎学（古代）畸胎学是发育毒理学的基础。畸胎学作为一门描述性科学在文字之前就已经存在了，四大文明古国都有畸胎的记载。最早可以追溯到公元前6500年土耳其的联体婴儿石刻。5000年前埃及壁画所描述的唇腭裂和软骨发育不全等。当时人们相信出生异常的婴儿是上天的惩罚、星象的反应和未来的预兆，有的则以为是人和动物之间杂交的结果。随着16~17世纪生物科学的发展，才逐渐对畸胎有了科学的认识。WilliamHarvey于1651年提出了发育受阻学说，认为畸形起因于器官或结构的不完全发育。第六页，共九十三页，2022年，8月28日现代实验畸胎学（19世纪）现代实验畸胎学始于19世纪初，当时的胚胎学家使用各种物理因素（震动、倒置、针刺）和化学毒物处理鸡蛋，产生了畸形小鸡，有神经管缺陷、无脑、脊柱裂、独眼、心脏缺陷、位置颠倒和联体双胞胎等。他们还注意到作用时间在决定畸形类型方面比损伤的性质更为重要。第七页，共九十三页，2022年，8月28日20世纪早期20世纪早期发现多种环境因素（温度、微生物毒素、药物）可以干扰鸟、爬虫类、鱼和两栖类的发育。开始人们以为哺乳动物胚胎对致畸因子具有耐受性，要么直接致死，要么受母体的保护，对胚胎没什么影响。1935年，Hale首次报道维生素A缺乏诱导母猪产下突眼和腭裂的畸形后代。此后又有一些研究发现母体营养缺乏和许多环境因素，如氮芥、锥蓝、激素、抗代谢药、烷化剂、缺氧和X射线等可以引起哺乳动物畸形。第八页，共九十三页，2022年，8月28日重大历史事件1940年澳大利亚发生风疹大流行，次年出生婴儿中先天性白内障、耳聋、智力发育不全和先天性心脏病的发生率显著增高。1945年日本广岛、长崎受原子弹核辐射的胎儿出生后患小头畸形和智力低下，婴儿一年内死亡率高达25%。1950年日本水俣湾甲基汞中毒发生先天性水俣病。1960～1962年间沙利度胺作为抗妊娠反应药物应用后，出现8000例海豹畸形儿，表现为四肢短缺陷、无眼、腭裂、骨骼发育不全、十二指肠和肛门闭锁等。1968年日本多氯联苯污染米糠油事件，孕妇出现死产、早产或产下“油症儿”。第九页，共九十三页，2022年，8月28日重大历史事件1969年发现，母亲妊娠18周前服用己烯雌酚，可诱发女性后代青春期阴道和宫颈透明细胞癌；男性后代则发生附睾囊肿、睾丸囊性硬结、小阴茎畸形及精子异常等。1970年Jone等描述了胎儿酒精综合征，包括面部畸形、宫内和产后生长迟缓、精神运动和智力发育障碍及其他畸形。孕期吸烟也可能引起不良妊娠结局，包括流产、围生期死亡、婴儿猝死综合征的危险性增加，学习和行为及注意力障碍，低出生体重等。可卡因暴露可引起多种不良发育效应，如胎盘早期剥离、早产和流产、小脑畸形、异常前脑发育、低出生体重、新生儿异常睡眠综合征、震颤、泌尿生殖道畸形等。酒精综合征第十页，共九十三页，2022年，8月28日发育毒理学在经历了一系列重大事件后，人们对先天出生缺陷与环境因子之间的关系才有了深刻的认识，与此同时，发育毒理学也得到迅速地发展。第十一页，共九十三页，2022年，8月28日第十二页，共九十三页，2022年，8月28日马丁·施奈德斯是荷兰第一个“反应停儿童”第十三页，共九十三页，2022年，8月28日美国反应停受害女孩第十四页，共九十三页，2022年，8月28日第十五页，共九十三页，2022年，8月28日第十六页，共九十三页，2022年，8月28日第十七页，共九十三页，2022年，8月28日第十八页，共九十三页，2022年，8月28日浙江某药厂一女工产后100天的女孩她只有一个半手指（2003）第十九页，共九十三页，2022年，8月28日是研究发育中的生物体从受精卵、妊娠以及出生后直到性成熟期间，由于暴露于外源性理化因素而产生的各种发育异常及其机制，为理化因素的危险度或安全性评价和预防措施提供依据的一门学科。发育毒理学developmentaltoxicology第二十页，共九十三页，2022年，8月28日发育毒性的危害现代研究发现，人类成功妊娠结局的比率很低，只有不到半数的受孕能产生完全正常的健康婴儿。美国的统计资料表明，着床后丢失（流产和死胎）占31%，着床前丢失（早早孕丢失）的比例更高。婴儿出生时有严重畸形的占2%～3%（到1岁时因诊断明确使该比率上升为6%～7%

），轻微畸形占14%，低出生体重占7%。1岁前婴儿死亡率1.4%，神经功能异常占16%～17%。我国29个省市，1986～1987年1234284例围生儿调查结果，先天畸形率1.3%。以此推算，我国每年有30万～40万严重先天畸形儿出生，其中很大比例在一年内死亡。第二十一页，共九十三页，2022年，8月28日小结发育毒理学(developmentaltoxicology）是研究发育中的生物体从受精卵、妊娠以及出生后直到性成熟期间，由于暴露于外源性理化因素而产生的各种发育异常及其机制，为理化因素的危险度或安全性评价和预防措施提供依据的一门学科。名词解释：第二十二页，共九十三页，2022年，8月28日第二节发育毒理学的基本原理第二十三页，共九十三页，2022年，8月28日一、基本概念发育毒性developmentaltoxicity

指出生前后接触有害因素，子代个体发育为成体之前诱发的任何有害影响。能造成发育毒性的物质称为发育毒物。发育毒性的主要表现：1.发育生物体死亡2.生长改变3.结构异常4.功能缺陷第二十四页，共九十三页，2022年，8月28日发育毒性的主要表现：1.发育生物体死亡：指受精卵未发育即死亡，或胚泡未着床即死亡，或着床后生长发育到一定阶段死亡。早期死亡被吸收或自子宫排出（即自然流产），晚期死亡成为死胎。2.生长改变：一般指生长迟缓。当胎儿生长发育指标低于正常对照的均值2个标准差时，可认定为生长迟缓。3.结构异常：指胎儿形态结构异常，即畸形。4.功能缺陷：包括生理、生化、免疫、行为、智力等方面的异常。功能缺陷往往要在出生后经过相当时间才被发现，如听力或视力障碍，生殖功能障碍等。另外，有时把子代对某些疾病的易感性增加也归入发育毒性，如孕期接触己烯雌酚，女性后代易患青春期阴道癌。近年来提出肥胖和糖尿病等成年疾病的胎源学说更增加了这方面的例子。第二十五页，共九十三页，2022年，8月28日胚体毒性（embryotoxicity）是指外源性理化因子对孕体着床前后直到器官形成期结束时的有害影响。胎体毒性或胎儿毒性（fetotoxicity）是指对孕体器官形成期结束以后的有害影响。胚胎毒性（embryo-fetaltoxicity）在实验动物发育毒性试验中，往往笼统地将胚体毒性和胎儿毒性叫做胚体-胎体毒性或胚胎毒性。广义地说胚胎毒性包括孕体结构和功能方面的各种损害，但一般情况下胚胎毒性是指孕体的死亡和生长发育迟缓，而不包括结构畸形。一、基本概念第二十六页，共九十三页，2022年，8月28日畸形（malformation）是发育生物体解剖学上形态结构的缺陷。能引起畸形的环境因子叫致畸物或致畸原，致畸物引起畸形的过程和特性叫致畸作用和致畸性。变异（variation）指同一种属的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，一般是小的或次要的结构改变。一、基本概念第二十七页，共九十三页，2022年，8月28日一、基本概念出生缺陷（birthdefect）是指婴儿出生前即已形成的发育障碍，包括畸形和功能缺陷。不良妊娠结局（adversepregnancyoutcomes）指妊娠后不能产生外观和功能正常的子代，包括所有的不良结果，如流产、死胎、死产、宫内生长迟缓、发育异常、新生儿和婴幼儿期死亡等。第二十八页，共九十三页，2022年，8月28日二、Wilson发育毒理学基本原理（一）对致畸的易感性取决于孕体的基因型及其与有害环境因子相互作用的方式。（二）对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期的不同而变化。（三）致畸物以特异的方式（作用机制）作用于发育的细胞和组织，启动一系列的异常发育事件（细胞病理机制）。（四）有害影响能否接近发育中的组织取决于有害影响本身的性质。（五）异常发育的四种表型是：死亡、畸形、生长迟缓和功能缺陷。（六）随着剂量的增加，异常发育表型的频率和程度也随之增加，从无毒作用到全部致死。第二十九页，共九十三页，2022年，8月28日二、Wilson发育毒理学基本原理（一）对致畸的易感性取决于孕体的基因型及其与有害环境因子相互作用的方式每种致畸物各有其易感物种和品系，易感性取决于机体的基因型。物种和品系的差异是因代谢变化、胎盘种类、胚体发育的速度和方式引起的。外源性化学物生物转化成活性中间产物的速度和途径与遗传有关，而畸形仅发生在那些形成活化代谢物的物种中。例如反应停4000mg/(kg·d)对大鼠和小鼠无致畸作用，而对人0.5~1.0mg/kg就有极强的致畸作用，这是由于人、猴和兔能将其代谢产生活性中间产物，而其他物种不能产生活性代谢产物。一种化学物在不同物种中的致畸作用，可能是不一致的，所以在筛选致畸物时，强调采用包括非啮齿类在内的两种动物进行试验，以减少因实验动物不敏感而出现的假阴性。第三十页，共九十三页，2022年，8月28日二、Wilson发育毒理学基本原理（二）对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期的不同而变化研究证明器官形成期是发生形态结构畸形的关键期，即致畸敏感期。在器官形成期的细胞分化阶段，要发生多种复杂易变的生物学事件，各种组织开始快速的细胞分裂，同时胚体的代谢能力有限；此阶段接触发育毒物，最易发生结构畸形，而一旦胚体的基本结构业已形成，就很难再改变其结构。人的器官形成期发生于妊娠的第3~8周。反应停致畸事件就在怀孕后的20~35天内，在无一般毒性的“安全剂量”[1mg/(kg·d)]下发生的，有的母亲甚至在这阶段内只服过一次药。第三十一页，共九十三页，2022年，8月28日二、Wilson发育毒理学基本原理（二）对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期的不同而变化此外，大多数器官都具有其特殊的致畸敏感期，即“靶窗”。形态畸形和功能缺陷的敏感期也各不相同。因此，致畸实验的染毒时间，必须安排在器官形成期，才有可能观察到畸形。由于各物种妊娠期长短不同，敏感期的长短也不同，致畸试验的染毒时间需随动物种属而异。第三十二页，共九十三页，2022年，8月28日二、Wilson发育毒理学基本原理（二）对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期的不同而变化在细胞分化之前接触发育毒物，则要么导致胚体死亡，要么从损伤中完全恢复。胎体发育期是功能成熟的阶段，此期接触发育毒物，其主要表现为生长迟缓、发育阻滞、生理功能紊乱和神经行为异常。然而，若毒作用导致局部供血中断，也同样可引起结构的退变即畸形。第三十三页，共九十三页，2022年，8月28日二、Wilson发育毒理学基本原理（二）对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期的不同而变化第三十四页，共九十三页，2022年，8月28日二、Wilson发育毒理学基本原理（三）致畸物以特异的方式（作用机制）作用于发育的细胞和组织，启动一系列的异常发育事件（细胞病理机制）脊椎动物的发育是一个循序渐进、受到精细调节的过程，从细胞水平的生长增殖到组织、器官系统水平的形态形成无不是有条不紊的依次完成。每个过程或水平的异常改变，均可永久性的改变发育过程。一般而言，发育毒物对发育中的胚体的最初效应往往是发生于分子水平，并构成该毒物影响发育的分子机制。其后的事件则包括细胞、组织及机体水平上的发育偏差，并构成发育异常的细胞病理机制。由于脊椎动物发育的复杂性，一种发育毒物可能通过多种机制在同一时间、对同一个生物体发挥作用，虽然有可能是某种机制发挥主要作用。同样，发育毒物还可通过同种或不同的机制在不同的器官引发发育异常，导致多种畸形。第三十五页，共九十三页，2022年，8月28日二、Wilson发育毒理学基本原理（四）有害影响能否接近发育中的组织取决于有害影响本身的性质有害影响能否接近发育中的组织一方面与其能否经胎盘转移有关，另一方面与孕体对毒物的暴露模式有关。过去，人们认为母胎血流之间的多层细胞和细胞间质对胚体具有保护作用，并称之为胎盘屏障。目前的研究则表明，这种保护顶多是一般性的，而胎盘膜事实上是一种超滤器。此外，还有多种化学物可利用胎盘对氨基酸和葡萄糖的特殊转运机制，经母体转移进入孕体。影响外源性化学物穿过胎盘的因素繁多，包括分子大小、荷电量、脂溶性、离子化程度、形成复合体、胎盘代谢和浓度梯度等。因此，胎盘仅能降低水溶性分子、大分子或电负性大的分子的转运；而X射线、超声和射频辐射等可不经胎盘，直接从体外作用于孕体。化学物的发育毒性不仅取决于胚体的总暴露量，更取决于暴露速率。因为暴露速率过低，对细胞不能造成显著的影响，同时胚体也有足够的时间去修复损伤。第三十六页，共九十三页，2022年，8月28日二、Wilson发育毒理学基本原理（五）异常发育的四种表型是：死亡、畸形、生长迟缓和功能缺陷孕体死亡是指受精卵未发育即死亡，或胚泡未着床即死亡，或着床后生长发育到一定阶段死亡。早期死亡被吸收或自子宫排出（即自然流产），晚期死亡成为死胎。能引起胚体死亡和畸形的毒物多数能引起生长迟缓。一般认为胎体的生长发育指标比正常对照的均值低2个标准差时，可认定为生长迟缓。胎鼠胸骨和枕骨骨化迟缓及低出生体重等是生长迟缓的较敏感指标。生长迟缓造成的局部发育不全可视为畸形，如脑小畸形和眼小畸形等。功能缺陷则包括器官系统、生化、免疫等功能的变化。功能缺陷往往要在出生后经过相当时间才能诊断，如听力或视力异常、行为发育迟缓等。结构异常是指胎体形态结构的异常，即畸形。胚体死亡、畸形及生长迟缓之间的关系相当复杂，并且可随受试化学物的种类、染毒时间及剂量不同而发生改变。第三十七页，共九十三页，2022年，8月28日二、Wilson发育毒理学基本原理（六）随着剂量的增加，异常发育表型的频率和程度也随之增加，从无毒作用到全部致死较大剂量致全窝胚胎死亡，一般剂量下正常、畸形和生长迟缓共存。常见反应模式。ABC在远低于胚胎致死剂量下即出现致畸，甚至全窝致畸，常伴有生长迟缓。强致畸剂，少见。低剂量引起生长迟缓，高剂量引起胚胎死亡。无畸形发生。发育毒性的剂量-反应模式致畸作用的剂量反应曲线较为陡峭第三十八页，共九十三页，2022年，8月28日发育毒性的影响因素1.机体因素：遗传因素：种属差异和个体差异2.化学物因素（1）化学物的理化性质（2）化学物的作用时间（3）化学物的剂量自己总结第三十九页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的间接影响因素母体毒性胎盘毒性父源性发育毒性其他因素（一）（二）（三）（四）第四十页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的间接影响因素(一)母体毒性母体毒性是指受试物对妊娠母体的有害效应，母体毒性可能特异（直接）的或非特异（间接）的影响发育过程，导致发育毒性。影响发育毒性的母体因素包括：1.遗传2.疾病3.营养4.应激第四十一页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的间接影响因素(一)母体毒性母体毒性与发育毒性之间的关系常见的有以下几种：1.具有发育毒性，但无母体毒性，表示发育毒性有特定的机制，与母体毒性无关。如沙利度胺。这类化学物最容易被忽视也最危险。2.出现发育毒性也出现母体毒性，尤其是当发育毒性只在母体毒性存在时才能被观察到的时候，发育效应可能是间接的，往往不具有特定的致畸机制。许多已知的人类发育毒物，包括乙醇和可卡因，主要在母体毒性水平对胚胎/胎儿有有害影响，它们的发育毒性可能部分归因于母体生理学紊乱的继发效应。如嗜酒者通常营养状态不良，而且酒精影响营养物的胎盘转运，可增强对孕体的直接效应。3.具有母体毒性，但不具有致畸作用。这类物质在妊娠期容易引起警觉，避而远之。4.在一定剂量下，既无母体毒性，也不表现发育毒性。第四十二页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的间接影响因素(二)胎盘毒性某些化学物可对胎盘造成损伤，改变胎盘血流量，降低胎盘对营养物质的转运，特异地干扰胎盘的内分泌和代谢功能，间接地引起发育毒性。5-羟色胺引起的小鼠动、静脉狭窄，胎盘血流量减少，胎盘转运功能障碍，死胎和先天畸形。甲基汞可改变人胎盘滋养层微绒毛对氨基酸的摄取，导致功能障碍（即先天性水俣病），患儿出现严重的神经迟钝、共济失调、步行困难、语言和下咽障碍以及癫痫大发作。第四十三页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的间接影响因素(三)父源性发育毒性越来越多的人群流行病学研究发现某些出生缺陷也与男性因素有关，被称为父源性出生缺陷。引起父源性出生缺陷的因素主要有：遗传缺陷年龄因素外界暴露因素第四十四页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的间接影响因素(三)父源性发育毒性有出生缺陷的男性，其后代出现出生缺陷的几率是正常人群的2倍，甚至高于母亲有出生缺陷的后代，其中患与父亲相同缺陷的危险性是正常人群的7倍。20~24岁的父亲所生的后代，与25~29岁的父亲所生的后代相比更容易得腹裂畸形，40岁以上父亲所生的后代患13号染色体三体综合征较少，但患乳腺癌的几率增加。外界暴露因素包括职业和环境暴露、化疗和放疗、其他药物以及饮酒、抽烟等不良嗜好。这些因子通过父亲对发育个体产生不良影响，因此叫作父源性发育毒性。父源性暴露可以引起的子代发育异常包括流产、死胎、低出生体重、畸形、功能障碍等，甚至可能与儿童肿瘤相关。第四十五页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的间接影响因素(四)其他因素染毒途径可影响致畸试验的结果，大鼠受孕等7~14天经口给予EDTA，引起70%的胎鼠畸形，但以同样剂量皮下注射，对母体毒性增加，却未见明显的胎鼠畸形。反应停对大鼠灌胃不引起胎鼠畸形，而经饲料染毒几乎全部肧体致死。第四十六页，共九十三页，2022年，8月28日小结发育毒性（developmentaltoxicity）指出生前后接触有害因素，子代个体发育为成体之前诱发的任何有害影响。畸形（malformation）是发育生物体解剖学上形态结构的缺陷。名词解释：第四十七页，共九十三页，2022年，8月28日小结Wilson发育毒理学基本原理（一）对致畸的易感性取决于孕体的基因型及其与有害环境因子相互作用的方式。（二）对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期的不同而变化。（三）致畸物以特异的方式（作用机制）作用于发育的细胞和组织，启动一系列的异常发育事件（细胞病理机制）。（四）有害影响能否接近发育中的组织取决于有害影响本身的性质。（五）异常发育的四种表型是：死亡、畸形、生长迟缓和功能缺陷。（六）随着剂量的增加，异常发育表型的频率和程度也随之增加，从无毒作用到全部致死。第四十八页，共九十三页，2022年，8月28日第三节发育毒性的作用机制第四十九页，共九十三页，2022年，8月28日一、异常发育的分子机制（一）干扰有丝分裂（二）能量供应的改变（三）代谢酶的抑制（四）氧化应激反应（五）干扰核酸代谢（六）基因表达改变（七）基因突变与染色体畸变（八）细胞凋亡第五十页，共九十三页，2022年，8月28日一、异常发育的分子机制（一）干扰有丝分裂肧体发育过程中，细胞增殖率高，但协调有序。因此，干扰有丝分裂，即改变细胞增殖速率是化学物诱发发育异常的一种常见方式。同一组织器官中的各类细胞的分裂速率不同，导致某些细胞对化学物暴露尤为敏感。一般而言，延迟或阻断细胞周期的各种理化因素均可干扰有丝分裂，而暴露毒物后引起的代偿性分裂速率增加也同样与致畸作用有关。影响细胞分裂的途径包括：1.DNA合成的降低；2.干扰细胞质的形成或分离；3.影响纺锤体的形成和维持。抗肿瘤药5-氟尿嘧啶抑制S期DNA合成，诱发结构畸形。第五十一页，共九十三页，2022年，8月28日一、异常发育的分子机制（二）能量供应的改变肧体发育过程中，生物合成、增殖活动旺盛，有氧代谢和氧化磷酸化也在妊娠过程中不断增加，因此，改变肧体的能量供应可引起发育异常。镇静和催眠药物苯巴比妥通过抑制线粒体呼吸，可引起骨骼畸形、枕骨及胸骨骨化延迟。第五十二页，共九十三页，2022年，8月28日一、异常发育的分子机制（三）代谢酶的抑制某些酶因为参与体内的合成或氧化代谢，尤其是DNA和RNA的合成，可影响细胞的生长与增殖，抑制其活性对肧体发育过程有较大的影响。抗肿瘤药甲氨蝶呤为二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂，宫内接触甲氨蝶呤可引起颅面部畸形、肢体变形和胎体生长迟缓。第五十三页，共九十三页，2022年，8月28日一、异常发育的分子机制（四）氧化应激反应用来治疗癫痫发作及洋地黄引起的心律过快的苯妥英经生物活化在亲体和肧体的组织引起脂质过氧化，蛋白质氧化和蛋白质降解，这些生物化学的变化可能是化学致畸的主要原因。第五十四页，共九十三页，2022年，8月28日一、异常发育的分子机制（五）干扰核酸代谢DNA与RNA的合成及正常功能的发挥对肧体细胞的增殖异常重要，因此干扰核酸的代谢可引起发育毒性。抗肿瘤药羟基脲可抑制核糖核苷酸还原酶，从而抑制DNA的复制，并诱发大鼠肢体、腭、下颌及尾的畸形和肧体死亡。第五十五页，共九十三页，2022年，8月28日一、异常发育的分子机制（六）基因表达改变发育过程中的基因表达具有特异性、协同性；因此，改变基因和蛋白质的表达可导致严重的发育后果。除基因序列改变以外，非基因序列所致基因表达水平和基因功能的改变，即表观遗传学改变，也影响胚胎的发育。第五十六页，共九十三页，2022年，8月28日一、异常发育的分子机制（六）基因表达改变有报道在培养的小鼠胚胎中用反义寡核苷酸探针抑制原癌基因Wnt-1或Wnt-3a的表达，都可产生中脑和后脑，或中脑、后脑和脊髓的畸形。孕鼠饲料中添加染料木黄酮等诱发DNA甲基化的化合物，可以改变子代皮毛的颜色。第五十七页，共九十三页，2022年，8月28日一、异常发育的分子机制（七）基因突变与染色体畸变胚胎发育过程中基因起控制作用，而化学物可使基因正常的控制过程发生转向，严重时胚胎发育可完全停止而死亡。已知的诱变剂往往有潜在致畸性，如电离辐射、烷化剂、亚硝酸盐等；多数致癌物引起基因突变和染色体畸变，也有致畸作用。有报道染色体畸变占人类发育缺陷原因的3%左右。第五十八页，共九十三页，2022年，8月28日一、异常发育的分子机制（八）细胞凋亡细胞凋亡又叫程序性细胞死亡（PCD），指肧体在遗传基因的控制下的特定类型的细胞死亡。PCD在肧体发育过程中可发挥多种作用，如为肧体提供合适的形态、除去残留的结构等。中枢神经系统的细胞在发育过程中，约有半数需通过PCD清除，以构建神经连接网络。由于PCD对正常的形态发生必不可少，因此，改变PCD的发生模式是致畸过程的一种重要机制；机体的畸形高发区，也常常是PCD的发生区域。第五十九页，共九十三页，2022年，8月28日一、异常发育的分子机制（八）细胞凋亡二恶英可通过改变PCD的正常模式，而诱发畸形。小鼠肧体上颚架的中央上皮细胞通常于妊娠第14~16天停止分裂，对表皮生长因子的反应性也随之降低；之后，中央上皮细胞与基底细胞脱离，绝大部分细胞通过细胞凋亡途径死亡。相反，在妊娠第10天接触二恶英的上颚架持续表达表皮生长因子受体，不发生上皮细胞的凋亡。第六十页，共九十三页，2022年，8月28日二、异常发育的细胞学机制（一）细胞死亡（二）细胞增殖（三）细胞信号通路的改变（四）影响细胞迁徙与分化第六十一页，共九十三页，2022年，8月28日二、异常发育的细胞学机制（一）细胞死亡早期肧体细胞保留较大的分化多能性，因此，发生细胞死亡后所存留的细胞可恢复因细胞死亡带来的细胞丢失，并对后期发育影响甚少。然而，当细胞死亡数量超出肧体的恢复能力时，则导致肧体死亡或畸形。细胞死亡的病理学后果，既取决于受损细胞的特性和所处的位置，又取决于细胞死亡的程度与范围。有很多化学物通过诱发受损的组织、器官的细胞死亡率增加，而引起发育异常。第六十二页，共九十三页，2022年，8月28日二、异常发育的细胞学机制（一）细胞死亡不同的组织对细胞死亡的敏感性也各不相同，如前脑神经上皮细胞对高热引起的细胞死亡异常敏感，而心脏和卵黄囊则对细胞死亡具有耐受性。免疫抑制剂环磷酰胺等化学物定向作用于增殖的细胞，首先导致细胞周期的改变，进而引起细胞凋亡。反之，维甲酸等发育毒物通过增加某些组织区已有的细胞程序性死亡，而引起发育异常。研究表明，接触维甲酸引起正常细胞死亡区域的死亡率增加，过多的细胞死亡则导致脊柱裂、指（趾）缺陷、颅面畸形。第六十三页，共九十三页，2022年，8月28日二、异常发育的细胞学机制（二）细胞增殖同细胞死亡一样，细胞增殖速率下降可减少组织细胞的数量，并影响后期的生长与分化。细胞增殖率下降既可能源于细胞周期进程的趋缓，也可能源于生长因子的缺乏、诱导因子的不足和细胞对外部因子反应性的降低。研究表明，抗癫痫药物丙戊酸、免疫抑制剂环磷酰胺等可通过干扰DNA合成而改变细胞周期的进程。小鼠体内研究发现，丙戊酸引起的细胞周期阻滞可能涉及神经上皮核糖核苷酸还原酶的改变，并与丙戊酸引起的神经管缺陷有关。第六十四页，共九十三页，2022年，8月28日二、异常发育的细胞学机制（三）细胞信号通路的改变细胞信号通路是肧体模式形成及分化的基础，也是决定发育毒物细胞病理机制的重要环节。信号通路通过分泌时空特异性分布的细胞产物来控制形态发生过程。其下游生物学事件通常为转录水平的改变，并导致靶细胞基因表达的变化。无论是改变信号分子的分泌，还是改变信号分子的转导，均可引起形态发生过程的实质性改变。信号转导的改变通常包括受体、转录因子、下游信号分子等的表达和间隙连接的分布这两个方面。第六十五页，共九十三页，2022年，8月28日二、异常发育的细胞学机制（三）细胞信号通路的改变发育毒物可通过诱发分化诱导子的缺乏，通过诱发影响到细胞分化、细胞增殖、死亡的靶细胞的缺失，通过信号分子生物合成的障碍，或通过干扰信号向靶细胞的传递，而改变形态发生过程中的细胞信号通路。实际上，多种环境化学物导致的出生缺陷的细胞病理机制都牵涉到细胞信号通路的改变。细胞毒药物可改变多条信号通路，而某些受体介导的致畸原，如维甲酸，则仅改变特定的信号通路。维甲酸可改变小鼠肧体的AER-EGF-4-ZPA信号通路，进而诱发肢体缺陷。第六十六页，共九十三页，2022年，8月28日二、异常发育的细胞学机制（四）影响细胞迁徙与分化在肧体发育早期，神经冠从神经褶背侧的神经上皮发育而来。在囊胚分层及上皮-间质转化的过程中，神经冠细胞脱离神经上皮，并开始迁徙；其后经过广泛的迁徙，神经冠细胞逐步分化为面部结缔组织、外周神经组织成分及黑素细胞等。由于神经冠细胞的迁徙分化对多种组织器官的发育必不可少，若发育毒物干扰这一迁徙分化过程（如抑制细胞骨架的形成），势必会造成肧体发育的广泛性受损。例如，维甲酸通常要参与后脑神经冠细胞命运的确定过程，然而，在较高的浓度下，维甲酸可改变神经冠细胞的特性，导致迁徙模式的变化和靶组织的结构畸形。第六十七页，共九十三页，2022年，8月28日维甲酸维A酸是体内维生素A的代谢中间产物。适应症：寻常痤疮、特别是黑头粉刺皮损，老年性、日光性或药物性皮肤萎缩，鱼鳞病及各种角化异常及色素过度沉着性皮肤病、银屑病。第六十八页，共九十三页，2022年，8月28日第四节发育毒性的评价第六十九页，共九十三页，2022年，8月28日发育毒性的评价流行病学调查动物发育毒性试验发育毒性的预筛试验第七十页，共九十三页，2022年，8月28日一、发育毒性的流行病学调查流行病学研究的目的：寻找出生缺陷的原因有助于了解出生缺陷的发展趋势引起公众对出生缺陷的注意第七十一页，共九十三页，2022年，8月28日二、动物发育毒性试验主要试验方案：1.三段生殖毒性试验主要用于评价药物的生殖发育毒性。1966年美国食品与药品管理局（FDA）首先提出，后经多次改进，我国食品药品监督管理局（SFDA）规定的新药生殖发育毒性试验也参照此方案。2.一代和多代生殖毒性试验主要用于评价食品添加剂、农药及其他化学物的生殖发育毒性。由美国环境保护局（EPA）首先提出。3.改进的大鼠发育神经毒性的试验程序。1988年EPA发布。第七十二页，共九十三页，2022年，8月28日连续、完整的生殖发育过程的六个阶段A.从交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育与成熟、交配行为、受精。B.从受孕到着床：检查成年雌性生殖功能、胚胎着床前发育、着床。C.从着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能、肧体发育、主要器官形成。D.从硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胎体的发育与生长、器官的发育与生长。E.从出生到断乳：检查成年雌性生殖功能、新生仔对宫外生活的适应性、断乳前的发育与生长。F.从断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长、对独立生活的适应、达到完全的性功能。第七十三页，共九十三页，2022年，8月28日三段生殖毒性试验主要是根据以上发育阶段的区别来设计的，每一段试验大致相当于上述两个阶段。Ⅰ段：生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）Ⅱ段：肧体-胎体毒性试验（致畸试验）Ⅲ段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验）三段生殖毒性试验分别为第七十四页，共九十三页，2022年，8月28日2周第七十五页，共九十三页，2022年，8月28日Ⅰ段：生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）目的：评价受试物对配子成熟、交配行为、生育力、胚胎着床的影响（前述生殖周期的A和B阶段）。给药期：雄性从交配前4周开始染毒，并持续至交配成功；雌性交配前2周开始染毒（以覆盖3~4个动情周期），至妊娠第6天受精卵着床。第七十六页，共九十三页，2022年，8月28日Ⅱ段：肧体-胎体毒性试验（致畸试验）目的：评价自胚泡着床到硬腭闭合阶段暴露受试物对妊娠母体和胚胎与胎仔发育的有害效应。包括母体毒性、胚胎或胎儿死亡、生长改变和结构异常。给药期：为着床期到硬腭闭合，即器官形成期；大、小鼠为受孕第6~15天，家兔为第6~18天。第七十七页，共九十三页，2022年，8月28日Ⅲ段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验）目的：评价母体从着床至断乳期间接触受试物对妊娠/哺乳母体和对胎仔及仔代直至性成熟的有害效应。给药期：着床期开始，至仔鼠断乳。大鼠孕15天至产后28天。第七十八页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的预筛试验（一）体外预筛试验（二）发育毒性的体内预筛试验（C.K试验）第七十九页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的预筛试验（一）体外预筛试验体外发育毒性试验方法操作简单，可严格控制试验条件，试验结果与整体动物致畸试验有较好的相关性（有母体毒性者除外）。因此可利用体外试验方法作发育毒物的初筛，预测对整体动物的发育毒性，发现毒作用的靶器官，或阐明发育毒性的作用方式和机制。体外试验系统使得快速筛选发育毒物成为可能，但体外模型缺乏发育过程的复杂性，试验结果外推到人类的发育毒性风险比整体动物试验大。此外，体外系统大多有待标准化和认证研究。第八十页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的预筛试验（一）体外预筛试验1.大鼠全胚胎培养2.胚胎细胞微团培养3.小鼠胚胎干细胞试验第八十一页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的预筛试验（一）体外预筛试验1.大鼠全胚胎培养将啮齿动物胚胎移植到体外培养，其生长与分化与在母体子宫内发育的胚胎相似。第八十二页，共九十三页，2022年，8月28日三、发育毒性的预筛试验（一）体外预筛试验2.胚胎细胞微团培养是孕期第11天的大鼠胚胎取得代表中枢神经系统的原代中脑细胞微团、肢芽区或其他区的细胞微团，在培养瓶中分别加入不同浓度的受试物共同培养5天。可以用中性红染色判断细胞存活；用Alcian蓝染色判断肢芽软骨细胞分化数量；苏木素染色判断中枢神经系统细胞分化数量。对结果进行处理，求出影响