实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术的研究进展及其在水产养殖中的应用M140101006高金伟摘要：实时荧光定量PCR的是继常规PCR之后分子生物学方法学研究的一大飞跃，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，在人类和动物疾病的快速检测、食品安全检测、定量分析、基因分型、基因表达研究、以及疫苗效力测定中广泛应用，已成为分子生物学研究的重要工具。本文从实时荧光定量PCR技术的原理、荧光标记技术、定量方法以及实时荧光定量PCR技术在水产养殖研究领域的应用现状作了一个综述。关键词：荧光定量；PCR；荧光标记；水产养殖实时荧光定量PCR技术(Real-timefluorescentquantitativePCR,real-timeFQ-PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。在荧光定量PCR技术发展的过程中，两个重要的发现起着关键的作用：一是TaqDNA多聚酶的5'端核酸外切酶活性被发现，它能降解特异性荧光标记的探针，使得间接检测PCR产物成为可能；另一个是荧光双标记探针被使用在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。在1996年由美国AppliedBiosystems公司推出了一种实时荧光定量PCR技术，它是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析［1］。该技术不仅实现了PCR从定性到定量检测的飞跃，而且所有反应均在同一溶液中进行，不需任何后处理过程，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高、能实现多重反应、定量结果具实时性和准确性等特点［2］。目前已得到广泛应用，包括对mRNA表达的研究、各种基因定量分析、点突变分析和等位基因分析、单核苷酸多态性分析、DNA甲基化的检测及对各种传染病进行定量定性分析。1实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。工作原理在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。而用于常规PCR的专门热循环仪配备荧光检测模块，可监测扩增时的荧光。荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。荧光探针法是指当标记在探针的5'端荧光报告基团(reporterR)未被标记在3’端淬灭基团(quencherQ)抑制时，可检测到报告基团的荧光信号。检测到的荧光信号的强度与PCR反应产物的量成正相关，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。定量原理实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。扩增曲线有指数增长期和非指数平台期2个阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，反应进入平台期(28~40个循环)。只有在荧光信号扩增期PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以在指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并由此推断模板最初的含量。设定一定的荧光信号的域值(threshold)。如果检测到荧光信号超过域值，就被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数Ct(C代表循环cycle,t代表域值threshold）［3］oCt值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。公式表示：Ct=-klogX0+b（X0指原始模板数）。利用已知起始拷贝数的标准品可做标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。2实时荧光定量PCR荧光标记技术实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。探针类荧光标记物是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，荧光染料是利用其它的一些理化特征指示扩增产物的增加。前者因增加了探针的识别步骤，特异性更高；后者的优点是简便易行。荧光标记探针按其基团标记和能量转移的方式,目前已经开发出几种相关的技术,大体可以分为水解探针和杂交探针两类。TaqManTM探针（水解探针）、TaqManMGB（水解探针）、Dual-oligoFRETpairs（双杂交探针）、MolecularBeacons（杂交探针）、ScorpionsTM/AmplifluorTM（杂交探针）、Universalprobelibrary-LNA（lockednucleicacids水解探针）、LUX（杂交探针）、Simpleprobe探针等［4］。水解探针TaqManTM及TaqMan系歹1」探针TaqManTM探针的长度为20~24bp,在其5’末端标记一个荧光报告基团，3’末端标记一个荧光淬灭基团，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。TaqManMGB探针是在TaqMan探针的基础上改进的，长度可缩短到13bp,在探针的3'端增加了MGB（minorgroovebinder）分子，能够结合双链DNA小沟部位，配对更容易，且节约了成本；MGB提高了探针的Tm值，能够分辨1个碱基的差别（完全配对才有荧光信号）；连在MGB分子后的是非荧光物质的淬灭基团，这种探针淬灭效果更好、无背景荧光、荧光标记灵活、提高荧光信号的信噪比等优点。TaqMan-分子信标（TaqMan-MB）是在分子信标及TaqMan探针的基础上设计的一种更好、无背景荧光、荧光标记灵活、提高荧光信号的信噪比等优点。TaqMan-分子信标（TaqMan-MB）是在分子信标及TaqMan探针的基础上设计的一种均相荧光检测探针，该探针保留了分子信标的茎环结构,有效解决了背景荧光的问题,不同在于除环部序列外,其5’端的臂序列有基因识别位点［4］。当进行PCR扩增时，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步［3］。常用的荧光基团是FAM、TET、HEX、TAMRA等［5］。Universalprobelibrary-LNA探针Universalprobelibrary-LNA（lockednucleicacids）是一种双RNA聚合的类似物，其2’-O,4’-C形成亚甲基的桥键,这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性,因而将其结构锁定成一个刚性的双环模式,因此而提高杂交效率和优越的稳定性。在5’端和3’端分别标记上荧光报告基团与荧光淬灭基团,单体掺入寡核苷序列可以增加形成体的Tm值,其稳定性比PNA高（PNAS2000,97:563325638）因LNA与DNA杂交较DNA与DNA、DNA与RNA甚至PNA与DNA杂交有更高的亲和性,故这种探针稳定性最好；而且探针实现了设计迅速简单、低成本的水解探针特点［6］。cycling探针cycling探针是一种由DNA、RNA构成的杂合探针，与RNaseH组合使用，内部含有RNA碱基,5’端和3’端分别标记荧光物质与淬灭物质。探针完整时,荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光。当探针与扩增产物中的互补序列杂交，RNaseH切断探针的RNA部分，淬灭作用解除,荧光物质发出荧光［7］。杂交探针分子信标技术分子信标(molecularbeacon)技术是一种在游离状态下呈茎-环结构(stem-loopstructure)的双标记寡核苷酸探针，是TaqMan探针的衍生形式。环形部分可与靶DNA序列互补，一般为15~30bp；茎部核苷酸互补，但与靶DNA无序列同源性，一般5~7bp。在3'和5‘端即茎环结构两条臂的末端分别标记荧光基团和淬灭基团。探针游离时呈发夹结构，两端的荧光基团紧密相邻荧光信号被淬灭；在PCR变性后复性阶段，分子信标与模板杂交，从而打开发卡结构形成FRET，淬灭基团的抑制作用被解除，释放出荧光信号，荧光的强度与溶液中分子信标的量成正比，也与被扩增的模板量相对应，从而实现了对目的基因的定量检测［8］。该方法优点是灵敏度高、特异性强、荧光背景低，其缺点是设计要求高、杂交探针不能完全与模板结合、稳定性较差、探针合成的时候标记较复杂。常用的荧光基团有FAM和TexasRed。2.1.2.2双杂交探针双杂交探针(Dual-oligoFRETpairs)又称为FRET探针或者LightCycle探针，采用两条相邻(距离1~5bp)、与模版互补的特异探针和一对序列特异性引物。第一个探针3’端带有荧光供体，第二个探针的5’端带有荧光受体。在3’端用荧光激发供体基团,在毗邻探针5’端受体基团处实施荧光信号监测。在PCR反应变性后退火，探针头尾相连地杂交在靶标序列上，因此两基团靠近，从供体到受体产生FRET发出荧光，受体荧光信号的增加与扩增子出现的量成比例［9］。检测时只检测受体基团发出的荧光；变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到荧光。该方法淬灭效率高，两条探针均与目的基因特异性结合才能检测到受体基团发出的荧光，检测的特异性增加。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析。但两个探针结合于模板上影响扩增效率，合成两个探针，成本相对较高。常用的荧光基团：LC-Red640和LC-Red705［10］。复合探针法该法结合了分子信标和LightCycler两种技术的优点，为使用非荧光淬灭剂，本底低，对扩增效率影响小，探针设计、合成、标记、纯化方便，是我国研究和开发的一种新型定量PCR技术。该技术的特点是先合成荧光探针后合成淬灭探针，荧光探针(25bp)5’端标以荧光报告基团，而淬灭探针(15bp)3'端标以荧光淬灭基团，淬灭探针能与荧光探针5’端杂交，吸收荧光信号［8］。当反应中无模板时，两探针结合形成复合探针，荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收，无荧光产生；当反应溶液中有模板时，在PCR复性阶段荧光探针优先与模板结合，两探针分离，产生荧光，其强度与PCR体系中模板数量成正比，可进行PCR定量［9］。2.1.3荧光标记引物荧光引物法是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它是把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中。目前主要有Amplifluor,Sunrise,Amplisensor,Scorpion,LUX(lightuponextent-ion)等。2.1.4其他探针Simple探针和神标荧光探针。Simple探针只在5’端标有报告荧光，在报告荧光和5’端之间连接一种“linker”结构，当在高温条件下，"linker”结构改变，释放荧光。这种探针的优点是不用淬灭基团，无背景荧光。神标荧光探针是AlleLogic公司新发明的一种荧光探针。该探针操作简单、成本低，效果比常规TaqMan探针增加60%，试验设备无需更换。它不需要荧光淬灭基团，是在单一链DNA序列上多重标记恰当的、易处理的荧光染料［11］。双链DNA(dsDNA)结合染料目前用于实时PCR的主要dsDNA结合染料SYBRGreenI是一种非饱和菁类荧光素，可以嵌合于DNA双链结构的小沟中，发射荧光信号；而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。结合dsDNA后荧光强度的增加与初始模板量相关，可以进行定量DNA分析。SYBRGreenI染料法与探针法相比，其检测方法更简便，同时降低了成本。但该染料能够结合任何dsDNA分子，特异性差；对PCR有一定的抑制性，且荧光强度低，稳定性差。目前已针对SYBRGreenI的缺点开发了一些改进染料，如SYBRGreenER、PowerSYBR等可以通过优化PCR的反应条件，减少或去除非特异性产物和引物二聚体的产生，另外，也可以借助融解曲线分析法来区分非特异性产物和引物二聚体而进行定性诊断。3实时荧光定量PCR技术的几种定量方法标准曲线法的绝对定量绝对定量FQ-PCR一般用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量［12］。该标准品可以是纯化的质粒DNA、PCR扩增产物、体外转录的RNA或者是化学合成的目的基因。标准品的量可根据260nm的吸光值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数确定。将标准品进行梯度稀释，并以此为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线。通过此标准曲线与被测样品的CT值，即可对样品进行定量。该法优点是稳定、准确。如果想要明确得到样本的初始浓度或病毒载量，则使用绝对定量法最佳。无参照基因法的相对定量在该方法同时扩增待测靶基因片段和一个内源性管家基因片段，测得两者的CT值之差。CT)，不需要标准曲线，而是运用数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到CT值来反映起始模板的量，1个循环(CT=1)的不同相当于起始模板数2倍的差异。比较不同待测标本的△CT值与正常标本的△CT值的变化，即可对待测标本靶基因的原始拷贝数作出判断，进而诊断出待测标本的病理状况。该法得出的结果也是目的基因同管家基因的比值。但是此方法以靶基因和管家基因的扩增效率基本一致为前提，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。以参照基因为标准的相对定量该法能准确的量化初始材料的载量，检测的结果是目的基因与参照基因的比值，只要参照基因恒定，比值的变化也就反映了目的基因的变化。由于结果是一个相对值，所以只需知道标准品的稀释梯度即可。此法的关键是选取参照基因，由于管家基因通常恒定表达且表达水平不易受外界实验条件影响，所以常作为参照基因，来衡量不同来源基因的表达量。常用的管家基因有B-actin、B2-微球蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶等(GAPDH)、18SrRNA等。该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较、显示反应体系内是否存影响PCR扩增的因素以及弥补样本组织量的差异。目前有2-A△CT(Livak)方法、用参照基因的△CT法进行相对定量的方法。4Real-timePCR技术在水产养殖研究中的应用病原体定量检测Real-timePCR技术最有价值的应用领域就是临床诊断。该技术可以快速、准确检测出高至101低至100个拷贝的病原体，定量检测范围极宽。目前该技术已广泛应用于水产养殖疾病(包括细菌、病毒等)的诊断，为预防和控制水产养殖动物的疾病提供了重要的技术支持。王忠发等［13］应用TaqMan探针技术建立了一种快速、特异、灵敏的实时荧光定量PCR检测对虾WSSV的方法。其灵敏度超过标准方法的101-105倍，特异性与标准方法100%吻合。检测时间为标准方法的1/24。张利峰等［14］运用探针技术建立了快速检测鲤春病病毒症(SpringViraemiaofCarp,SVC)的荧光实时定量RT-PCR技术，并应用该技术对病鱼的组织脏器中的病毒分布和病毒量进行了分析。结果发现，该病毒在肠、肾和鳃组织的含量最高，肌肉、脑组织次之。基因表达研究Real-timePCR技术在水产养殖领域的另一个重要的应用就是特定基因表达水平的研究，即水产养殖动物生理变化相关的细胞因子的转录水平的评估。目前检测细胞因子表达变化的方法很多，但是由于传统的蛋白质检测方法（如ELISA）灵敏度较低，常规PCR方法检测mRNA无法定量的缺点，Real-timePCR技术以其敏感、准确定量等优点在检测各组织细胞mRNA表达水平，特定基因在不同组织中的表达水平及特定基因在不同时期的表达差异、比较正常组织与病理组织中各种mRNA表达量差异等方面具有广阔的应用前景［15］。Johansen等［16］利用实时定量PCR技术定量检测彩虹鲑鱼新陈代谢相关的基因及肌肉特异性基因的表达水平的变化，研究了其在经历长时间的饥饿再恢复喂食过程中的新陈代谢情况，及恢复喂食后鲤鱼肌肉的生长速度。药物及疫苗功效考核针对水产养殖动物感染性疾病（病毒病、细菌病等）和其他特定生理方面的需要而研制的疫苗和药物，在开发过程中，快速了解疫苗和药物的功效，可以为其开发节约大量的人力、时间和资金。因此对于药物及疫苗的疗效的评估就显得很重要。Real-timePCR技术可以快速、准确定量、灵敏地测定特定免疫蛋白的基因表达水平来间接的评价疫苗和药物的功效。宋艳等［17］运用TaqMan探针为基础的实时荧光定量PCR技术，研究了GnRH-A及其配伍对鱼卵成熟、受精相关基因ZP3的调控。研究结果显示，LHRH-A2+DOM组合既能使ZP3基因表达达峰时间显著提前，又能显著提高表达峰值，可能是较好的鱼类催产药物配伍。水产品的快速商检江河、湖泊、近海等水源的污染是导致水产品不安全的一个重要因素。而利用这样的水源生产的水产品常常会受到细菌、病毒等病原微生物的污染，严重影响到了水产品的安全性，给人体造成潜在的威胁。如软体类、虾类、鱼类等是重要的水产品，同时也是多种人类病原微生物的中间宿主。Real-timePCR技术在水产品快速商检上的应用无疑为水产品安全提供了关键技术。蔡潭溪等［18］应用TaqMan探针的Real-timePCR方法，定量检测海产品中副溶性弧菌（Vibrioparahaemolyticus），与传统的细菌培养方法和生化鉴定相比，具有更加省时、操作简便和定量准确等优点，对水产品中存在的副溶性弧菌的监控有着重要的实际意义。4.5养殖水环境的实时监测生物标志物Biomarker作为指示污染物危害效应的早期生物信号，对其研究有助于早期识别外来污染物对水产养殖动物的影响，从而有利于水产养殖环境的危险度评估。目前国内外已经有很多学者报道了实时定量RT-PCR技术应用于定量检测生物标记物。CYP450基因的表达可受许多因素的影响，体外许多化学物质（如氟甲氧氟烷、二乙醚、三氯乙烯、氯仿等）对CYP450基因表达有诱导作用，上调CYP450基因的表达［19］。因此，可以把CYP450基因作为三氯乙烯、氯仿、苯、对乙酰氨基酚等有机物污染的生物标记物。Rees等建立了SYBRgreen实时定量PCR技术直接定量检测经B-萘黄铜诱导后大西洋鲑鱼Salmosalar各组织CYP1A基因的表达水平，并应用于评估米罗河中多氯化联苯的含量［20］。5展望Real-timePCR技术是核酸检测和定量技术的一次飞跃，对现代分子生物学的研究过程中起到了重要的作用。随着Real-timePCR技术的不断改进与完善以及新的荧光化学物质的不断开发，Real-timePCR技术在水产养殖领域的应用越来越广泛，已逐渐成为科研的重要工具。随着Real-timePCR技术与微解剖技术、肽核酸技术和生物芯片技术等先进技术的整合，水产养殖中遇到的一些技术难题很容易得到解决，其未来的应用前景是令人鼓舞的，对水产分子生物学的发展有着深远的影响，必将在水产养殖的研究中发挥巨大的作用。参考文献：RajeevanMS,RanamukhaarachchiDG,VernonSD,etal.Useofreal-timequantitativePCRtovalidatetheresultsofcDNAarrayanddifferentialdisplayPCRtechnologies[J].Methods,2001,25:443-451.KeLD,ChenZ,YungWK.Areliabilitytestofstandard-basedquantitativePCR:Exogenousvsendogenousstandards[J].MolecularandCellularProbes,2000,14(2):127-135.⑶李文涛，王俊东，杨利峰，等.实时荧光定量PCR技术及其应用J].生物技术通讯,2006,17(1):112-114.MarisaL,WongandJuanF.Medrano.Real-timePCRformRNAquantitation[J].BioTechniques,2005,39:75-85.[5]蒋春燕，王泰健，王琴等.实时荧光定量PCR技术[J].动物医学进展,2005,26(12):97-101.⑹赵焕英，包金风.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展J].中国组织化学与细胞化学杂志.2007,16(4):90-93.[7]邓文星，张映.实时荧光定量PCR技术综述J].生物技术通报,2007(5):94-95.⑻胡骑，程安春，汪铭书.荧光定量技术的研究进展及应用J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine,2006(11):32-34.[9]郭杨，陈世界，郭万柱，等.荧光定量PCR技术及其应用研究进展J].动物医学进展,2009,30(2):78-82.[10]袁媛，陈强，陈思祗，等.实时荧光定量PCR技术及其在生命科学领域中的应用J].海峡预防医学杂志,2006,12(5):18-20.[11]葛忠源，熊东艳，张启勇.实时荧光定量PCR技术及应用J].中国牧业通讯，2008(13):12-14.ThomasDSchmittgen1&KennethJLivak,Analyzingreal-timePCRdatabythecomparativeCTmethod[J]