大肠菌群检验操作规程

*****〔沈阳〕儿童制品文件编码第*****〔沈阳〕儿童制品文件编码第1页共6页大肠菌群计数检验操作规程颁发颁发部门质量部□复审□页数2页文件治理标准■操作标准□ 文件编码质技术标准□ 原编编码起草审年月日核批QC年月日执行年月日质量治理部、QC一、目的建立大肠菌群计数检验的标准操作程序，使操作过程标准化。二、适用范围适用于大肠菌群计数的检验操作。三、职责检验人员严格按检验操作规程进展检验。QC主管监视检查执行状况。四、程序范围〔coliforms〕的测定术语和定义大肠菌群：在肯定培育条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。设备和材料除微生物试验室常规灭菌及培育设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培育箱：36℃±1℃，30℃±1℃。3.2冰箱：2℃～5℃。3.3恒温水浴箱：46℃±1℃。天平：感量为0.1g。均质器。振荡器。无菌吸管：1mL〔具0.01mL刻度、10mL〔具0.1mL刻度〕或微量移液器及吸头。500mL。无菌培育皿：直径90mm。pH计或pH比色管或周密pH试纸。菌落计数器。4.培育基和试剂月桂基硫酸盐胰蛋白胨〔LaurylSulfateTryptose，LST〕AA.1。煌绿乳糖胆盐〔BrilliantGreenLactoseBile，BGLB〕肉汤：见附录AA.2磷酸盐缓冲液：见附录A中A.3。无菌生理盐水：见附录A中A.4。1mol/LNaOH：见附录AA.5。1mol/LHCl：见附录AA.6。检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。检样25检样25g(mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释3个适宜稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管36℃±1℃ 48h±2h不产气产气BGLB肉汤36℃±1℃48h±2h不产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性MPN表报告结果1大肠菌群MPN计数法检验程序操作步骤样品的稀释25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min1:10的样品匀液。25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶〔瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠〕中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。pH值应在6.5～7.51mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。〔留意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面用11mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。依据对样品污染状况的估量，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递11支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不15min。初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液〔液体样品可以选择原液1mL，则用LST肉汤，36℃±124h±2h，观看倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气48h±2h，产气者进展复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。复发酵试验1〔BGLB〕管中，36℃±148h±2h，观看产气状况。产气者，计为大肠菌群阳性管。大肠菌群最可能数〔MPN〕的报告MPNg〔mL〕样品中大肠菌群MPN值。A〔标准性附录〕培育基和试剂附录〔LST〕肉汤成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g〔K2HPO4〕2.75g〔KH2PO4〕2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000mLpH6.8±0.2制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调整pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。12115min。〔BGLG〕肉汤成分蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g牛胆粉〔oxgall或oxbile〕溶液 200mL0.1%煌绿水溶液 13.3mL蒸馏水 800mLpH7.2±0.1制法500mL200mL〔20.0g脱水牛胆粉200mLpH7.0～7.5975mp10mL。12115min。磷酸盐缓冲液成分磷酸二氢钾〔KH2PO4〕 34.0g蒸馏水 500mLpH7.2制法500mL175mL1mol/L氢pH1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压15min。无菌生理盐水成分氯化钠 8.5g蒸馏水 1000mL制法：8.5ｇ1000mL蒸馏水中，12115min。1mol/L NaOH成分NaOH 40