同等学力串讲分子生物学文老师

1同等学力临床医学考试

分子生物学

（考前串讲）第一部分2一、氨基酸（aminoacids）

——组成蛋白质的基本单位存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-α－氨基酸（甘氨酸除外）。第一章蛋白质化学H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R4甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00缬氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98异亮氨酸

isoleucineIleI

6.02苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非极性疏水性氨基酸5色氨酸

tryptophanTrpW

5.89丝氨酸

serineSerS

5.68酪氨酸

tyrosineTyrY

5.66

半胱氨酸

cysteineCysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagineAsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

苏氨酸

threonineThrT5.602.极性中性氨基酸6天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22赖氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76组氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.碱性氨基酸7R—CH—COOHNH2R—CH—COO-NH3+R—CH—COOHNH3+R—CH—COO-NH2(pH<pI)(pH=pI)(pH>pI)OH-OH-H+H+pk1pk2

1、两性解(电)离及等电点等电点(isoelectricpoint,pI)—在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。氨基酸的理化性质8

2、紫外吸收

芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸等）的最大吸收峰在280nm附近（近紫外区）。芳香族氨基酸的紫外吸收

3、茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成紫色化合物。脯氨酸与茚三酮水合物共热，可生成黄色化合物。

(微量氨基酸定性或定量分析)9肽键（—CO—NH—）是蛋白质的基本结构键

H2N—C—C—OHHR1OR2H—N—C—COOHHHH2N—C—C—HR1OR2N—C—COOHHH+-H2O氨基酸残基1氨基酸残基2肽键

二、肽键和肽

肽键（peptidebond）——是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。肽(peptide)——是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。

10三、蛋白质的分子结构

二级结构（种类）三级结构四级结构

α-螺旋β-折叠β-转角无规卷曲

（二级与三级之间）亚层次模体(超二级结构）

结构域基本结构：一级结构空间结构分子结构11（一）蛋白质的一级结构

蛋白质的一级结构——指多肽链中氨基酸的排列顺序。主要的化学键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。

多肽链中氨基酸的排列顺序，肽键是主要连接键。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。12（二）蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要化学键：

氢键

主要形式：

-螺旋

-折叠-转角无规卷曲13(1)右手螺旋，每圈含3.6个AA(2)肽键平面与螺旋长轴平行，螺圈之间形成氢键(3)R分布在螺旋外侧（脯氨酸可以破坏-螺旋）-螺旋14-折叠-转角

无规卷曲并非完全“无规”和“卷曲”，而是有序和稳定的，经常构成蛋白质分子的功能部位。15模体（motif）—通常具有特征性氨基酸序列，由2-3个在空间相互靠近的二级结构单位（如α螺旋、β折叠）组成，形成特定的折叠模式、和蛋白质分子的某种功能密切相关，又称为超二级结构。钙结合蛋白中结合钙离子的模体锌指结构模体是蛋白质发挥特定功能的结构基础16纤连蛋白分子的结构域

结构域（domain）——在球蛋白分子中，在二级结构或超二级结构的基础上形成的独立的折叠单位，通常由100-300个连续的氨基酸残基组成，并具有一定的生物功能。17（三）蛋白质的三级结构主要化学键：疏水键离子键氢键二硫键VanderWaals力等。

整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。（较大的蛋白质分子三级结构一般含有两个以上结构域）。N端

C端肌红蛋白(Mb)18分子伴侣（molecularchaperone）——在蛋白质合成时，未折叠的肽段常需分子伴侣和异构酶的协助，才能正确折叠。在细胞内存在一类蛋白质，可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合，随后松开，引导肽链正确折叠，此类蛋白质称为分子伴侣。（热休克蛋白、Hsp70蛋白）值得注意的是：并非所有的具有生物学功能的蛋白质分子均必须折叠成特定的三维结构。近年来已发现近百种天然蛋白质分子完全没有折叠成特定的三维结构，其一级结构特征是富含亲水性氨基酸残基（特别是带电荷的氨基酸），而疏水性氨基酸残基较少，此类蛋白质被称为“天然非折叠蛋白质（NUP）”或者“内在非结构蛋白质（IUP）”。在全部蛋白质分子中，大约30%具有部分非折叠结构。19（四）蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。亚基——是指参与构成蛋白质四级结构而又具有独立三级结构的多肽链。血红蛋白的四级结构2021N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)

HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)

（一）蛋白质一级结构与功能的关系一级结构是空间构象的基础。例：镰刀形红细胞贫血四、蛋白质结构与功能的关系22肌红蛋白与血红蛋白的结构

（二）蛋白质空间结构与功能的关系

血红蛋白由4个亚基组成，每个亚基都有一个血红素结合氧，一个亚基结合氧可以引起另一个亚基的构象发生改变，使之更容易结合氧，此种一个氧分子与Hb亚基结合后引起亚基构象变化，称为别构效应。Hb的氧离曲线呈S形。23（一）蛋白质的两性电离

蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。

蛋白质的等电点(pI)

——当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。体内蛋白质的等电点多在pH5.0左右五、蛋白质的理化性质24两性解离和等电点H+PCOOHNH3+PCOO-NH3+PCOO-NH2OH-OH-H+阳离子两性离子阴离子（pH<pI）（pH=pI）（pH>pI）25（二）蛋白质的分子大小与形状分子大小与形状分子量范围从大约6000到1000000或更大形状纤维蛋白（不溶于水）球蛋白（一般溶于水。但膜蛋白是特殊的球蛋白，不溶于水，其疏水性氨基酸残基侧链多伸向外部）26水化膜酸碱酸碱酸碱+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质

等电点的蛋白质++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒脱水作用脱水作用脱水作用（三）蛋白质的胶体性质蛋白质呈亲水胶体的两个稳定因素：

颗粒表面电荷（双电层）；水化膜酸碱27（四）蛋白质的紫外吸收由于3种芳香族氨基酸残基（特别是色氨酸和酪氨酸）的存在，蛋白质具有较强的紫外光吸收能力，最大吸收波长为280nm，可用于蛋白质的定量测定。少量小蛋白质或多肽不含有芳香族氨基酸，其紫外光吸收能力来自肽键，肽键的最大吸收波长为215nm。利用这一性质，可测定蛋白质溶液的浓度和含量。28（五）蛋白质的变性和复性蛋白质的变性——在某些物理和化学因素的作用下，维持蛋白质特定的空间结构的次级键被破坏而导致其理化性质改变及生物活性的丧失。变性的本质：

破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。变性的因素：高温、高压、电离辐射、超声波、紫外线及有机溶剂、重金属盐、强酸强碱、pH、尿素、SDS、盐酸胍（6-8mol/L）等。29

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性

蛋白质的复性——若蛋白质变性较轻，去除变性因素后，有些蛋白质可恢复或部分恢复原有构象和功能。（六）蛋白质的呈色反应显色剂与蛋白质发生颜色反应，颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，可用于蛋白质的定性和定量分析。常用显色剂：考马斯亮蓝、氨基黑等。此外，还有银染法等。30六、蛋白质的分离、纯化

蛋白质分离与纯化的原理主要是依据蛋白质的理化性质决定的。根据：1、蛋白质的分子大小2、蛋白质溶解度的差别3、蛋白质带电荷的不同

4、蛋白质对配体分子的亲和力不同31蛋白质分离与纯化方法比较方法原理种类用途根据分子大小的纯化方法透析法利用透析袋半透膜只允许小分子通过的性质，可将蛋白质大分子物质与盐等小分子物质分离。透析法除去蛋白质中的盐类、浓缩蛋白质超滤法利用压力或离心力，强行使小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上。超滤法离心利用物质密度的不同，经离心后，分布于不同的液层而分离。密度梯度离心超速离心*分离纯化蛋白质*测分子量凝胶过滤法（分子筛）蛋白质混合物通过由凝胶颗粒填充的柱子，大分子蛋白质不能进入颗粒而先流出，小分子蛋白质进入颗粒而流出滞后。琼脂糖(Sepharose)葡聚糖（Sephadex）等*分离纯化蛋白质*测分子量*脱盐利用溶解度差别的纯化方法盐析法破坏蛋白质亲水胶体的稳定因素：双电层和水化膜，使蛋白沉淀，不同蛋白质沉淀时所需盐浓度不同。常用中性盐有：硫酸铵、硫酸钠等初步分离混合蛋白质pI沉淀等电点时相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀有机溶剂萃取*有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低，使蛋白质的水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀*该方法易使蛋白变性，操作中注意控制条件丙酮、乙醇、异丙醇等低温、控制有机溶剂浓度可分离纯化蛋白质32根据电荷的不同的纯化方法电泳蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷，因此在电场中可以移动。迁移率主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子形状与分子量大小琼脂糖凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳双相电泳等*分离鉴定蛋白质*测亚基分子量离子交换层析在某一pH时各蛋白质所带电荷不同，根据与固定相结合力与洗脱条件不同而分离阳离子交换树脂阴离子交换树脂HPLC分离纯化蛋白质利用对配体亲和力差异的纯化方法亲和层析用与蛋白质进行特异结合的配基为固相，使流动相中能与配基特异结合的物质得到分离浓缩免疫亲和层析金属螯合层析等分离纯化蛋白质方法原理种类用途33

凝胶层析（分子筛）34

离子交换柱层析35

亲和层析36七、蛋白质组和蛋白质组学

蛋白质组（proteome）——是指某种细胞或组织中基因组所表达的全部蛋白质，包括在不同环境、不同状态或不同发育阶段细胞蛋白质水平的变化。

蛋白质组学(proteomics)——主要研究各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的分子结构、功能及其相互作用，包括在不同环境、不同状态（正常和癌症等各种病理状态）、不同发育阶段、不同组织细胞中蛋白质分子的种类、结构和功能，以及蛋白质分子之间的相互作用，最终目的是为人类健康服务，发现疗效高、不良反应小的新药。37一、核酸的化学组成

98%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。10％分布于细胞核、其余在细胞质。

(DNA)

(RNA)脱氧核糖核酸

核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。

第五章核酸化学38核酸的基本组成单位——核苷酸分子组成有3部分：——碱基：嘌呤碱，嘧啶碱——戊糖：核糖，脱氧核糖——磷酸39核酸的存在部位、功能和化学组成核酸DNARNA存在部位主要在细胞核主要在细胞质功能遗传信息的载体遗传信息的表达化学组成戊糖2-脱氧核糖核糖碱基嘌呤腺嘌呤A、鸟嘌呤G腺嘌呤A、鸟嘌呤G嘧啶胞嘧啶C、胸腺嘧啶T胞嘧啶C、尿嘧啶U磷酸磷酸磷酸40核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。二、核酸的分子结构（一）核酸的基本组成单位——核苷酸41123561'2'3'4'5'415´端3´端核苷酸的连接

核苷酸之间以3',5'磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。CGA5

ACTGCT3人类基因组长度为3.2×109个碱基对（bp），编码蛋白质的基因约有3万多个。421.DNA的一级结构DNA的一级结构——脱氧核苷酸序列。5′端3′端CGA(二)DNA的分子结构43

2.DNA二级结构——双螺旋结构模型(B型)

DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟及小沟相间。碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对-A=T;GC.相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10.4对碱基。碱基组成-Chargaff

规则：[A]=

[T]、[G]

[C]以氢键配对44DNA双螺旋结构的多样性45真核生物染色质由DNA和蛋白质构成，其基本单位是——核小体。（核小体—是染色质的基本组成单位）（DNA：约200bp

组蛋白：H1、H2A，H2B、H3、H4原核细胞染色体是指大部分遗传物质组成的单一环形双链DNA分子。46

染色质存在：真核细胞中组成：DNA、组蛋白、非组蛋白形式：常染色质、异染色质在有丝分裂中期，染色质经过压缩可以产生染色体。4.DNA的功能基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。47（三）RNA的分类、结构与功能

RNA的主要功能是控制蛋白质的合成。参与蛋白质合成的RNA主要有3大类:

信使RNA（mRNA）转运RNA（tRNA）核糖体/核蛋白体RNA（rRNA）占细胞%3-5%15%80%作用是蛋白质合成的模板，其编码区中每3个碱基组成1个特异的氨基酸密码子，将遗传信息传递给蛋白质。转运特异的氨基酸和识别模板mRNA中的密码子核糖体中的rRNA，是核酶（具有催化功能的RNA），催化肽键形成，并且和几十种蛋白质组装成核糖体，是合成蛋白质的场所此外:还有一些其他类型的小分子RNA。48SD序列：原核生物mRNA的5'非翻译区的一段序列，是核糖体复合物的形成位点.原核mRNA翻译起始部位有特殊的碱基序列--SD序列

在起始密码AUG上游7～10个碱基处有一段富含嘌呤的序列，其共有序列为AGGAGG，称为SD序列（长4～6个碱基）。此处对于翻译的正确起始十分重要。1.信使RNA(mRNA)49真核mRNA结构特点1.大多数真核mRNA的5´末端都已7-甲基鸟嘌呤-三磷酸核苷（m7GpppN）为起始结构，这种结构被称为帽子结构。它是由鸟苷酸转移酶加到转录后的mRNA分子上的。5´帽子结构提供信号使核糖体小亚基与之结合，保护mRNA免受核酸酶降解，并且与成熟的mRNA从核内输送到细胞质有关。2.帽子结构后面是5´-UTR,编码区，3´-UTR，3´末端有polyA尾。3.大多数真核mRNA的3´末端有一个含20～

250个腺苷酸的多聚腺苷酸（polyA)结构，称为多聚A尾。（polyA尾不是DNA编码的，而是转录后加工产物，组蛋白没有polyA尾）。4.polyA尾是真核mRNA成熟的标志之一。50hnRNA

内含子(intron)mRNA

mRNA成熟过程

外显子(exon)mRNA

外显子(exon)mRNA

hnRNA

mRNA

内含子(intron)hnRNA

mRNA

外显子(exon)内含子(intron)hnRNA

mRNA

脊椎动物、植物和酵母的mRNA起始密码子及其附近存在保守的共有序列，即Kozak序列。51mRNA的功能

把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。DNAmRNA蛋白质转录翻译原核细胞

细胞质细胞核DNA内含子外显子转录转录后剪接转运mRNAhnRNA翻译蛋白质真核细胞

52

tRNA的二级结构—三叶草形氨基酸臂tRNA的三级结构—倒L形tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。（tRNA含稀有碱基比较多）2、转运RNA（tRNA）53rRNA的结构：一大一小两个亚基3、核糖体RNA（rRNA）rRNA的功能参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。核糖体大小大、小亚基rRNA蛋白质种类原核生物70S50S23S,5S3330S16S21真核生物80S60S28S,5S,5.8S4940S18S33rRNA的种类（根据沉降系数）54动物细胞内主要的RNA种类及功能细胞核和胞液线粒体功能核蛋白体RNArRNAmtRNA核蛋白体组成成分(不均一核RNA)hnRNA成熟mRNA的前体信使RNAmRNAmtRNA蛋白质合成模板转运RNAtRNAmtRNA转运氨基酸细胞内小RNA核内小RNAsnRNA参与hnRNA的剪接、转运核仁小RNAsnoRNArRNA的加工和修饰胞质小RNAscRNA蛋白质内质网定位合成信号等

55

近年来，广泛存在于真核生物的微RNA（miRNA）和小干扰RNA（siRNA）称为研究热门。

微RNA（miRNA）是一类长约22(约20～25）个核苷酸的单链RNA，是参与调控生长发育（时序）的基因。

小干扰RNA（siRNA）是一类长21～25个核苷酸的双链RNA，产生于病毒感染或其他双链RNA诱导以后，其功能是引起特异的靶mRNA降解，以维持基因组稳定，保护基因组免受外源核酸入侵和调控基因表达等，这一细胞反应过程称为RNA干扰（RNAi）。56三、核酸的理化性质和应用核酸可以被核酸酶水解（限制性内切酶是基因工程的工具酶）。核酸在260nm处有最大光吸收。加热等可以使核酸变性，双链解开，产生增色效应。

DNA变性的本质是双链间氢键的断裂57

DNA的紫外吸收光谱增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。加热使一半DNA变性时的温度称为融解温度（熔解温度），以Tm表示。其大小与G+C含量成正比。DNA的GC含量越高，Tm值越大。58热变性DNA缓慢冷却时，两条解开的DNA链可以恢复双螺旋结构，这一复性过程叫做退火。DNA复性后，光吸收降低，这一现象称为减色效应。利用不同来源的DNA进行退火，如果它们含有互补序列，就可以得到杂交分子，即形成分子杂交。杂交类型：

DNA－DNADNA－RNARNA－RNA59

（二）酶的分子组成和结构

1.单纯酶：仅由氨基酸构成的酶。如脲酶、淀粉酶、脂酶等

第二章酶学一、酶的一般特性

（一）概念

1.酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。

2.核酶是具有催化功能的RNA分子。

酶蛋白：决定酶的特异性辅因子小分子有机物

2.全酶金属离子辅基:与酶蛋白结合牢固

辅酶:与酶蛋白结合疏松

（透析易除去）60由若干空间上相互靠近的氨基酸残基组成的与酶催化活性直接相关的区域。活性中心内的必需基团的作用

结合基团－与底物相结合

催化基团－催化底物转变成产物

（调节亚基：变构酶有）3.酶的活性中心或称活性部位61（三）酶促反应的特点

1.酶易失活（变性）

2.酶的催化效率极高

3.酶对底物的专一性

4.酶的活性可受到调控

（四）酶的活力

1.酶活力：是指其催化某一化学反应的能力。

通常利用在一定条件下所催化的反应速度表示酶活力大小

2.酶活力单位

⑴概念：在一定条件下和时间内，将一定量的底物转化成

产物所需要的酶量。（U/g或U/ml）

⑵国际单位(IU)：在最适反应条件下（250C），每分钟催

化1微摩尔底物转化成产物所需的酶量定义为１个IU。62

⑶比活力：表示酶的纯度。用每毫克蛋白质所含酶活力单位数表示（U/mg）。比活力越大,酶的纯度越高。3．转换数和米氏常数

⑴转换数（Kcat）：是酶的催化常数。其定义为在一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数或每秒钟每微摩尔酶转换底物的微摩尔数。多数酶的Kcat范围是每秒1－104。

⑵米氏常数（Km）：是酶的特征性常数。在数值上等于酶促速度达到最大速度一半时的底物浓度(mol/L)。

Km可近似地表示酶与底物亲和力的大小。Km越小，酶与底物的亲和力越大，所以酶的最适底物的Km最小。63

⑶米氏方程：基于酶反应的中间复合物学说，表示底物浓度与酶反应速率的定量关系。v=

⑷Kcat/Km比值：作为酶催化效率的参数。比值越大，酶的催化效率越高。Vmax[S]Km+[S]64二、酶的催化机制（一）过渡态、活化能和结合能在一个化学反应体系中，反应物分子的能量有高有低，只有处于较高能量状态的活化分子才能进行反应。根据酶-底物反应的中间复合物学说：E＋SESE＋P过渡态中间产物ES复合物的生成，降低了反应活化能，因而大大加快反应的速度，故其催化效率极高。（二）酶催化作用的机制在酶促反应中，ES复合物的形成过程，既是专一性的识别过程，更是分子间反应变为分子内反应的过程，其涉及到多种效应。酶催化作用的机制类型有:邻近效应、一般酸碱催化、亲核催化、亲电催化、静电效应和诱导契合。多数酶蛋白在催化过程中同时利用两种或两种以上催化机制。65反应总能量改变

非催化反应活化能

酶促反应活化能

一般催化剂催化反应的活化能能量

反应过程底物产物

酶促反应活化能的改变活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。66三、酶活性的调控多种因素影响酶促反应的速度。如：酶浓度、底物的浓度、温度、pH、抑制剂和激活剂等；同时，参与酶活性的调控也有许多环节，包括：基因表达调控、激素、蛋白酶解激活、反馈抑制、可逆共价修饰、别构调节等。67基态反应物在反应前的能量状态。过渡态（活化态）指反应物在反应途径中能量最高、最不稳定的形式，此时化学键正在断裂或形成过程之中。活化能在一定温度下，1摩尔底物全部进入活化状态所需的自由能，等于过渡态和基态的自由能差（KJ/mol）。结合能是形成酶-底物复合物过程中释放的能量，主要来自酶和底物之间结合的次级键，每个次级键的形成都释放出少量自由能。这是降低酶促反应活化能和稳定过渡态的主要能量来源。基态、过渡态、活化能和结合能的概念68常见酶的催化作用机制类型类型概念（特点、举例）邻近效应底物与酶形成复合物后，使反应基团在空间上相互靠近，而使有效浓度极大升高一般酸碱催化化学键的断裂和形成需要转移电子。通过某种方式增加反应基团固有的亲核性或亲电性，提高其反应能力。简单的方式就是在反应基团（如酶活性中心的功能基团）上增加或去除一个质子。亲核催化（共价催化）酶利用其富含电子的亲核基团，攻击底物缺少电子的亲电中心，二者结合形成共价中间物。常见酶的亲核基团有：Ser侧链-CH2OH、Cys的-CH2SH、Lys的-NH2和His的咪唑基等。其主要特点是改变了反应历程（生成了共价中间物），以稳定过渡态。亲电催化酶利用其缺少电子的亲电体，攻击底物富含电子的亲核中心的酶促反应。如很多酶利用其金属离子（Zn2+，Mg2+等）作为亲电体直接参与催化过程。静电效应阳离子过渡态中的正电荷（如正碳离子），或阴离子过渡态中的负电荷（如氧阴离子），可通过酶活性中心带负电荷的Asp、Glu侧链，或带正电荷的Arg、Lys侧链及金属离子稳定之，此称为静电效应。诱导契合酶蛋白结合底物（或抑制剂）时，其三维结构（构象）发生变化，不仅使活性中心的功能基团获得必需的空间位置，而且为形成和稳定过渡态提供必要的次级键。69常见的酶活性调节方式酶活性调节方式概念特点（举例）共价修饰不可逆共价修饰蛋白酶解激活许多酶在细胞内合成后，仅为无活性的前体（酶原），然后通过蛋白酶在特定位点水解去除部分肽段后，变成活性蛋白，又称酶原的激活。*酶原激活实际上是酶活性中心形成或暴露的过程。*特点是：不可逆共价修饰；可在细胞外进行,一般不消耗能量*举例：消化酶、凝血酶、蛋白激酶以及补体系统等。可逆共价修饰化学修饰调节某些酶在其它酶催化下，使其肽链上的特殊基团发生可逆的共价修饰，快速改变酶活性，称为化学修饰调节，或酶共价修饰调节。*主要方式：可逆的磷酸化、腺苷化、甲基化、乙酰化和二硫键还原与氧化等。*常见的是可逆磷酸化，通过对特定的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的-OH磷酸化和去磷酸化。*磷酸化和去磷酸化分别由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化完成。有的蛋白激酶将ATP的γ-磷酸基团转移到靶细胞的基因上。

非共价修饰别构调节别构剂非共价可逆地结合在酶的别构中心，引起酶蛋白构象改变，从而影响酶的活性称别构调节。这种酶称为别构酶。*别构酶是寡聚酶；由活性中心（结合并催化底物）和别构中心（非共价结合别构剂）组成。*动力学曲线呈S形，不是米氏方程特有的双曲线。意义：底物浓度的微小变化可引起反应速度发生巨大的变化，有利于在底物浓度较低时调节细胞代谢反应。*别构效应的概念适用于别构酶以外的其它蛋白质，典型的例子是血红蛋白结合氧的过程。70四、核酶（Ribozyme）

定义：具有催化功能的RNA分子。

类型：类型I和类型II自我剪接内含子M1RNA(存在于RNaseP,参与tRNA前体加工) 锤头核酶（拟病毒和类病毒基因组） 发卡核酶 丁肝病毒的正、负链RNA VsRNA（线粒体逆转录因子质粒） 核糖体大亚基rRNA(肽酰基转移酶活性) gRNA(参与RNA编辑) 某些snRNA(参与真核mRNA前体剪接)

特点：催化反应动力学特征与蛋白酶相似

Km低(RNA与底物结合的专一性较强)

Kcat低(催化速度慢)71基因(gene)——是遗传物质的功能单位，主要存在于染色体上，其编码的功能产物为蛋白质或RNA。基因组(genome)——某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指全部的DNA序列。中心法则第六章DNA的生物合成(复制)与损伤修复遗传信息的流向：DNA

RNA

蛋白质72复制(replication)——是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。遗传信息通过亲代DNA分子的复制传递给子代。一、DNA复制(一)核酸合成的一般规律1．多数以DNA链为模板链，按照碱基互补原则进行合成。RNA病毒以RNA链为模板链。2．核酸合成的方向只有一个：5’→3’，这一过程需要耗能，能量来自底物NTP（或dNTP）。3．特异的聚合酶催化核酸的生物合成。73（二）染色体DNA复制的一般特征

1.半保留复制(semi-conservativereplication)：

DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板，按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制是DNA复制最重要的特征。亲代DNA子代DNA复制742.复制叉：

双螺旋DNA复制时，在DNA复制生长点一般形成呈叉形（或Y形）的结构，称之为复制叉。3.双向复制：

由一个复制起点形成移动方向相反的两个复制叉，这种方式最为普遍。754．半不连续复制：

在复制过程中，DNA一条链的合成方向和复制叉前进的方向相同，可以连续复制，所合成的链称为前导链（leadingstrand）；而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向相反，不能连续复制，只能先合成若干的小片段，这些小片段被称为冈崎片段(Okazakifragments)，冈崎片段再连接起来，这条新合成的链称为随从链（后随链）（laggingstrand）。这种方式称为半不连续复制。

765．复制起点：

是指DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列。细菌、质粒、病毒和酵母通常具有比较明显的复制起点。细菌和酵母的复制起点长约200～300bp。哺乳动物染色体的复制起点，迄今仍未阐明其特征。

复制子(replicon)：是一个独立的DNA复制单位，包括复制起点和复制终点在内的整个复制区域。细菌只有一个复制子，真核生物有多个复制子。复制子776．引物：

所有DNA聚合酶均不能从游离的核苷酸开始合成DNA链，必须利用引物提供自由的3’-OH末端,

通过加入核苷酸使DNA链得以延伸。引物的主要形式是RNA，少量的病毒（噬菌体）以DNA或者核苷酸（结合蛋白质）为引物。7．参与DNA复制的酶：

DNA复制是一个非常复杂的过程，需要30多种酶和蛋白质参与，包括①DNA聚合酶；②解链、解旋酶类；③引发酶；④DNA连接酶等。此外，在复制的起始、延伸和终止阶段均需要其他酶和蛋白因子参与，包括DNA拓扑异构酶等。78参与DNA复制的物质

模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写DNA-pol其他的酶和蛋白质因子798．DNA复制的高度忠实性：

DNA复制的误差只有10-10至10-9，以保证物种遗传的保守性，又能通过变异不断进化。复制方式：1．多起点双向（真核生物）2．θ型（大肠杆菌）3．滚环（病毒和噬菌体）4．D-环（线粒体）5．2D-环（叶绿体）80（三）大肠杆菌DNA的复制复制的过程起始(initiation)延长(extension)终止(termination)811、复制起始：（1）辨认起始点，合成引发体：E.coli复制起始点oriC被DnaA蛋白辨认结合，DnaB蛋白具有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白结合于起始点，DNA双链局部被打开，引物酶及其他蛋白加入，形成引发体（primosome）。（2）形成单链：

拓扑异构酶使分子的超螺旋构象变化，使DNA分子避免打结、缠绕等，在复制全过程中起作用。

解链酶的作用是解开双链。

解螺旋酶在蛋白因子的辅助下打开DNA双链。

单链结合蛋白SSB结合于处于单链状态模板链上；（3）合成引物：

引发体中的引物酶（引发酶DnaG）催化合成RNA引物,

引物长度11-12nt，5’端为pppAG,由引物提供3’-OH基,使复制开始进行。8283842、复制延长：（1）复制方向：一个起始点oriC，两个复制叉同时向两个方向进行复制，称为双向复制。

（2）链的延长：在DNApolIII的作用下，使链延长。3、复制终止：（1）复制终点：原核生物如E.coli，两个复制叉的汇合点就是复制的终点。（2）切除引物：由RNA酶切去领头链和随从链中的引物，引物留下的空隙由DNApolI催化自5’→3’

方向延长填补。（3）DNA连接酶：将两个不连续片段相邻的5’-P和3’-OH连接起来，成为连续的子链，复制完成。85555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶复制的终止：随从链上不连续性片段的连接86其他：

1、细菌内的质粒排斥同一类型质粒进入同一细胞，这一特点称为质粒的不相容性。2、反义RNA(antisenseRNA)——能够互补和杂交于一个基因特异的转录产物（例如复制引物或者mRNA），并抑制其功能的RNA分子。87

1、原核生物的DNA聚合酶有三种DNA-polⅠ功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅡ功能：

它参与DNA损伤的应急状态修复。

（在无DNApolI和DNApolIII时起作用,具有

3’→5’核酸外切酶活性。）DNA-polⅢ功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶（DNA复制）。

5’→3’聚合活性，3’→5’核酸外切酶活性（四）DNA聚合酶88323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端枯草杆菌蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

892、真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性(合成引物)。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制,修复。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol90DNA聚合酶性质比较（均具有5’→3’聚合酶活性）亚基数目3’→5’外切酶活性5’→3’外切酶活性功能原核生物DNA聚合酶I1＋＋切除引物、修复（切口平移）DNA聚合酶II1＋－修复DNA聚合酶III≥10＋－复制（延长过程）真核生物DNA聚合酶α4－－引物合成DNA聚合酶β1－－修复DNA聚合酶γ2＋－线粒体DNA复制DNA聚合酶δ2＋－核DNA复制DNA聚合酶ε5＋－填补缺口、修复91（五）端粒和端粒酶

端粒(telomere)——真核生物染色体线性DNA分子末端的特殊结构。由特殊的重复序列组成；对染色体的稳定性起重要作用，防止后随链最后一个冈崎片段复制的不完全。

端粒酶——是一种核糖核蛋白(RNP)，具逆转录酶活性。端粒酶以自己的RNA组分为模板，以后随链模板DNA的3’端羟基为引物，合成并延长后随链。

功能：维持染色体的稳定性。维持DNA复制的完整性。9293（六）DNA复制的忠实性

DNA复制的保真性至少要依赖三种机制

1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能(’5’核酸外切酶活性)。94二、DNA损伤修复

DNA损伤——是指在生物体生命过程中DNA双螺旋结构发生的任何改变。

引起因素：细胞内部的各种代谢产物；外界的物理、化学因素和DNA分子本身在复制过程中发生的自发性改变。

修复机制：保证遗传信息的高度稳定性。在一定条件下，生物机体能够使受到损伤的DNA得到修复。95（一）直接修复

类型：光修复和暗修复。

机制：光修复作用是高度特异的直接修复方式。光修复由光修复酶催化进行，此酶被可见光激活，可以分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。96（二）切除修复（复制前修复）

定义：是将DNA分子的损伤部分切除，并以另一股完整的DNA链为模板，重新合成被切除的片段，使DNA恢复正常结构。

修复酶：特异的内切酶、外切酶、聚合酶和连接酶

修复系统分类：原核及真核生物均有两套切除修复系统①碱基切除修复系统②核苷酸切除修复系统971.碱基切除修复系统DNA糖苷酶DNA糖苷酶特异识别DNA中发生改变的碱基，例如，胞嘧啶脱氨基产生的U,并通过水解将其除去，接着AP核酸内切酶迅速识别这个丢失碱基的裸露位点，在其5’端切断磷酸二酯键，再由磷酸二酯酶切除脱氧核糖磷酸残基。最后，由DNA聚合酶和连接酶将缺口修复。2．核苷酸切除修复系统98

3.错配修复在DNA复制完成以后，依赖模板提供的信息，对新生链上的错配碱基进行修复。错配修复可以将复制精确度提高100～1,000倍。步骤：①识别双链 ②寻找错配碱基 ③切除修复99（三）重组修复（复制后修复）（四）应急反应（SOS）从大肠杆菌到真核生物，细胞都有一种紧急应激反应（SOS）机制，这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。直接修复、切除修复、错配修复和重组修复能够识别DNA的损伤或错配碱基而加以消除，在它们的修复过程中并不明显引入错配碱基,因此属于避免差错的修复。100三、反转录

反转录（逆转录）——以RNA为模板、以dNTP为原料、由反转录酶催化合成DNA的过程。这一过程刚好与转录相反，所以被称为反转录，这种酶叫作反转录酶（逆转录酶）。

反转录酶兼有3种酶的活性：

1.RNA指导的DNA聚合酶 2.DNA指导的DNA聚合酶 3.RNaseH。逆转录酶无校对功能，错配率高。这可能是各种RNA病毒突变率高，不断出现新病毒株的原因。101逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA模板RNA指导的DNA聚合酶DNA-RNA杂化双链RNaseH单链DNADNA指导的DNA聚合酶双链DNA102一、转录（transcription）（一）转录、基因表达和中心法则

转录——生物体以DNA为模板合成RNA的过程。

不对称转录——双链DNA只有一股单链用作转录模板(模板链);而另一股单链作为编码链，且模板链并非永远在同一单链上。第七章RNA生物合成和加工103基因表达——指基因携带的遗传信息转变成为表型的过程。最常见的基因表达产物是蛋白质和多肽，其次是RNA。转录是基因表达的第一步。104复制转录模板两股链均复制模板链转录（不对称转录）原料dNTPNTP酶DDDPDDRP产物子代双链DNAmRNA，tRNA，rRNA配对A-T，G-CA-U，T-A，G-C注：DDDP是依赖于DNA的DNA聚合酶；DDRP是依赖于DNA的RNA聚合酶

复制与转录的区别1055′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C编码链（正链DNA）模板链（负链DNA）mRNA（正链RNA）蛋白质转录翻译106RNA聚合酶（RNApol）——是以双链DNA的一条链为模板，以NTP为原料催化RNA生成的酶。

RNApol不同于DNApol，它无校对功能，不需引物参与聚合反应。

新的RNA链的合成方向为：5＇→3＇。（二）RNA聚合酶(RNApolymerase,RNApol)RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别RNA聚合酶DNA聚合酶

模板单链DNA双链DNA引物不需要需要起始启动子起始区延伸40nt/s900bp/s终止子合成的RNA模板DNA校正功能无有107原核生物的RNA聚合酶注：α2ββ’为核心酶，起催化RNA链延长的作用

有多种(如：70)，识别不同基因的启动子

亚基分子量亚基数目功能

α365122决定哪些基因被转录β1506181催化功能,形成磷酸二酯键β＇1556131结合DNA模板

702631识别启动子,辨认起始点,转录起始全酶：2+核心酶：2108真核生物的RNA聚合酶种类ⅠⅡⅢ细胞内定位核仁核质核质转录产物45SrRNA,加工hnRNA5SrRNAtRNA产生3种rRNAU1-U5snRNAU6snRNA-鹅膏蕈碱耐受极敏感中度敏感利福霉素敏感敏感敏感真核生物RNA-Pol比原核生物RNA-pol复杂,含13-15个亚基,分三类核心亚基

共同亚基：3种RNA-pol共有

特异亚基：每种RNA-pol有4-7个RNA-polⅡ的最大亚基的C端结构域(CTD)：若干个7肽重复序列(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser)在转录和转录后加工时期作用。109（三）启动子(promoter)和增强子(enhancer)

顺式作用元件：

指能够调节基因表达的核酸序列。包括：启动子、增强子、操纵子和沉默子。顺式作用元件通过反式作用因子起作用。

反式作用因子：

指能够调节基因表达的因子。通常是蛋白质（如转录因子），也可能是RNA。反式作用因子直接或间接与顺式作用元件相互作用。1101.启动子（promoter）：

是RNApol识别、结合和开始转录的一段DNA序列。

（1）细菌启动子特点：

有转录起点：转录起点的碱基90%以上是嘌呤。

-10序列

-35序列

分别以-10序列、-35序列为中心，各含6bp，其中富含A/T。原核生物的启动子区有两个高度保守的序列：-35区的TTGACA序列：RNApol的转录起始辨认位点-10区的TATAAT（Pribnow盒）序列：为转录起始位点

-10和-35序列之间保持一定间隔距离

一般为16-18bp，在空间上利于RNApol的结合。不同的启动子与RNApol的亲合力不同，是影响转录频率的重要因素。111开始转录TTGACAAACTGT-35区(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10区1-30-5010-10-40-205335原核生物启动子保守序列RNA-pol辨认位点(recognitionsite)55RNA聚合酶保护区结构基因33112（2）真核生物的启动子特点：

启动子必须与转录因子（TF）结合才能被RNA聚合酶识别与结合。

真核基因的启动子包括转录与调节所必需的位点，主要是转录因子结合位点。蛋白质编码基因的启动子在转录起始上游-100-200bp范围内。分类：

核心启动子：包括TATA盒和起始子。决定转录起点

启动子近侧序列元件：位于核心启动子上游约-100bp处。包括GC盒、CAAT盒和OCT(八聚体)

等。决定启动子的转录效率和特异性。注：TATA盒结合蛋白(TBP)具有结合TATA盒的作用。

1132、增强子(enhancer)：

定义：是一段DNA序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件，能调控（常为增强）邻近基因的转录活性。

部位：一般位于转录起始点上游或下游50kb处，但在基因外或某些内含子中也有增强子序列。

特点：增强子的转录激活作用与其位置和序列方向无关。

有些增强子具有组织特异性

有些增强子属于可诱导增强子

负增强子(negativeenhancer)又称沉默子(silencer)对基因表达起负调控作用。114

TATA盒

CAAT盒

GC盒

增强子顺式作用元件

结构基因-GCGC---CAAT---TATA转录起始真核生物启动子保守序列1153、内含子（intron）和外显子(exon):

内含子：是存在于结构基因或RNA中能转录但不被翻译的序列。

外显子：是结构基因或RNA中既能被转录又能被翻译的序列。

116（四）转录因子(TF)

转录因子——是指RNApol起始转录需要的辅助因子(蛋白质)。通常结合于启动子或增强子区。转录因子为反式作用因子的一种。

转录因子含两种结构域：

①DNA结合结构域：负责识别并结合特异的顺式作用元件

有4种模体：螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)锌指结构(zincfingermotif)亮氨酸拉链(leucinezipper)螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)

②激活结构域:负责与转录装置中的其他组分相互作用并激活转录。117（五）终止子及终止因子

1.终止子：是提供转录停止信号的DNA序列。

2.终止因子：是协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）。

原核生物的终止子有两种类型：

①不依赖ρ因子的终止子：

转录产物3’端形成富含G/C的发夹结构，转录终点出现寡聚U，使RNA聚合酶脱离模板而终止转录。

②依赖ρ因子的终止子：

ρ因子与RNA聚合酶相互作用以终止转录。118RNA生物合成的抑制剂

特点举例嘌呤和嘧啶类似物*人工合成的碱基类似物，6-巯基嘌呤（碱基类似物）能够抑制和干扰核酸的合成5-氟尿嘧啶DNA模板功能的抑制剂*与DNA结合，使DNA失去转录烷化剂,放线菌素D的模板功能，从而抑制其复制嵌入染料和转录RNA聚合酶抑制剂*抑制革兰氏阳性菌和结核分

利福霉素枝杆菌的RNA聚合酶的亚基;抑制真核生物的RNA聚合酶α-鹅膏蕈碱（六）RNA生物合成的抑制剂119二、转录过程

原核生物与真核生物转录的区别

原核生物

真核生物

起始阶段①RNA聚合酶全酶(2)与模板结合；比原核生物复杂。②DNA双链解开；启动子由转录因子所识别，多种③在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合转录因子和RNApol在起点上形反应形成转录起始复合物成前起始复合物而促进转录RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3。

延伸阶段①亚基脱落，RNApol核心酶变构，过程与原核大致相同。因有核膜与模板结合松弛，沿DNA模板前移；相隔，没有转录与翻译同步的现②在核心酶作用下，NTP不断聚合，象；RNApol前移处处遇上核小

RNA链不断延长，核苷酸间以体；可观察到核小体移位和解聚3’5’磷酸二酯键相连。现象。终止阶段①RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来在读码框架下游，有一组共同序不再前进；列AATAAA，再下游还有相当多的②转录产物RNA链从转录复合物上脱落。GT序列，称为转录终止的修饰点有依赖ρ因子与不依赖ρ因子两种方式。120121三、转录后加工

原核生物细胞无细胞核膜阻隔，转录的初始产物加工简单而且可边转录边翻译。真核生物转录生成的RNA需加工修饰后，再转入胞液，进行翻译。（空间与时间存在间隔）122原核生物的转录后加工rRNA前体tRNA前体mRNA前体①转录产物（30S）经过5’端由RNAaseP切割加工大多不需要加工RNAaseⅢ切割，产生3’端由RNAaseD加工。少数需核酸内切16SrRNA，23SrRNA，包括:酶切割后再翻译5SrRNA的中间前体；①核酸内切酶两端切断；②核酸内切酶和外切酶加工②核酸外切酶切去3’端及甲基化修饰至成熟。附加序列；③3’端加-CCA-OH；④核苷酸的修饰和异构化123真核生物的转录后加工注：对rRNA自我剪切加工的研究中，发现了“核酶”（Ribozyme），它是具有锤头型或发卡型二级结构并具有催化活性的一类核糖核酸。

rRNA前体tRNA前体mRNA前体核仁是rRNA合成和加工