备课素材：植物体细胞杂交原生质体再生能力的检验-高二下学期生物人教版选择性必修3

植物体细胞杂交原生质体再生能力的检验先看一道试题：甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：（1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备▲的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的▲为外植体。（2）植物细胞壁的主要成分为▲和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的▲失活。对处理后的原生质体在显微镜下用▲计数，确定原生质体密度。两种原生质体1:1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是▲。（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于▲。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项?▲(A.甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂B.同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂C.培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂D.杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂)（4）愈伤组织经▲形成胚状体或芽。胚状体能长出▲，直接发育形成再生植株。（5）用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：I.提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的▲。Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系，▲为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。Ⅲ.得到的2个PCR扩增产物经▲后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的▲个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。答案：（1）再生植株叶片（2）纤维素细胞质、细胞核血细胞计数板终止原生质体融合（3）一个融合原生质体ABD（4）再分化根和芽（5）模板M1、M2电泳1这是2023年1月浙江选考24题，试题考查的是选择性必修3植物体细胞杂交过程，包括原生质体的融合、杂种细胞的选择和杂种植株的选择。知识点包含植物细胞工程和基因工程。试题中出现了多个填空很难确定，特别是第一空“在体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生植株的能力。”从试题的提示角度来看（根据研究目标），提供的填空答案还是有一定的道理，只不过教材中没有相关的知识。但很多老师产生了疑问，为什么要鉴定和如何鉴定原生质具备植株再生能力？需要说明的是，原生质体培养对密度也有较高的要求，具体密度因植物材料、物种及基因型不同而异。一般培养密度是104-105个/ml，太密太疏都不好。所以，试题中出现了原生质体的计数。1.关于原生质体获取、培养和再生植株的研究原生质体是去除细胞壁的裸露植物细胞。1893年，Klercker第一次尝试用利刃对细胞进行机械切割而获得原生质体，产量和效率都很低。1960年，Cocking采用真菌培养物中的纤维素酶来降解番茄根细胞壁，获得原生质体。1972年，Takebe等首次获得烟草叶肉原生质体培养的再生植株。在20世纪80年代中叶，先后从水稻和油菜原生质体培养出再生植株。原生质体培养的研究成功，不仅是生命活动理论研究的一个良好体系，还可改良作为的某些性状，潜力巨大。原生质体培养再生植株技术是细胞融合、体细胞杂交的基础。体细胞杂交能使有性过程不能杂交的亲本之间进行遗传物质重组，在农作物育种上有广阔的应用前景。近一二十年来，原生质体培养取得了可喜的成果。据统计，1993年有分属于49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主要是农作物和经济植物，但从一年生扩展到多年生，从草本到木本、从高度植物到低等植物，如食用菌、藻类等。原生质体培养目前已成为体细胞遗传学、遗传工程和改良作物品种等方面的新途径。2.原生质体再生植株途径原生质体分化为再生植株通过两种途径：一种途径是将原生质体再生的愈伤组织直接转移到分化培养基上，一步成苗。关键是选择适合的培养基并调节生长素和细胞分裂素的平衡。另一种途径是由先将愈伤组织培养在含细胞分裂素（一般为0.5-2.0mg·L-1）和低浓度2，4-D（一般为0.02-0.2mg·L-1）的分化培养基上，形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再将其转到含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。3.原生质体材料的选择由于原生质体的获取目的是进一步进行其他方面的研究和应用，所以外植体的选择很重要，要获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。植物的年龄、季节、光照、肥水条件等都明显影响原生质体的质量。普遍采用的外植体有根、下胚轴、幼叶、子叶等，生长在温室里的植株较好。不少人采用叶肉细胞分离原生质体，其优点是来源方便，供应及时，有明显的叶绿体，也便于在融合中认识。禾本科植物中，常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料。最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。在酶解游离原生质体之前对植株进行预处理，有时可提高原生质体培养中的分离频率。预处理的方式有暗处理、低温处理或预先在组织培养的培养基上进行预培养。4.原生质体的再生能力虽然每个原生质体都有再生分裂的潜在能力，因为都有全套的遗传物质，但在培养基中只有一部分能分裂。除植物种类基因型外，还主要取决于培养基的培养条件。如烟草叶肉原生质体在植物组织培养常用基本培养基NT培养基上培养一周，分裂频率为54.9％，如在2N-11培养基上培养同样时间，则可达82.8％。待小愈伤组织长至1mm左右时，及时将其转入固体培养基上使其进一步生长。培养基组成一般与愈伤组织培养基相同。原生质体再生能力不仅在种间、品种间，甚至单株间都可能存在明显差异。所取器官或组织不同，也会影响原生质体的再生能力。如禾本科叶肉和愈伤来源的原生质体，则全能性难以表达。其原生质体再生体系绝大部分均有胚性细胞悬浮系所建立。有胚性悬浮细胞所分离的月季原生质体也得到了再生能力。从叶片分离的原生质体遗传背景较为一致，并且叶绿体可为选择杂种细胞提供了天然标记。而起源于愈伤组织和悬浮细胞的原生质体会产生一定的遗传和生理变异，但其再生能力强于叶片来源的原生质体。因此应根据所培养的材料和应用的不同来选择游离材料。总之，自第1例1972年烟草原生质体再生植株到现在已经有50多年的历史。原生质体再生体系研究取得了突破性进展，但仍然有多例植物未能得到再生植株。植物原生质体能否再生与材料的内在因素和培养过程中的外界因素密切相关。只有在适宜的内在因素并配合一定的外在因素的条件下，才可实现植物原生质体再生。内在因素包括植物基因型和生理状态。在遇到难培养的基因型时，通过改变植物生理状态，选择合适的外植体，提供适宜的培养条件，并配合适当的培养基，就有望获得原生质体再生植株。因此，试题中的再生植株能力是不是还应该包含原生质体再生所需要的多种因素的确定。例、为探究矮牵牛原生质体的培养条件和植株再生能力，某研究小组的实验过程如下图。下列叙述正确的是（

）A.过程①获得的原生质体需悬浮在30%蔗糖溶液中B.过程②需提高生长素的比例以促进芽的分化C.过程③需用秋水仙素处理诱导细胞壁再生D.原生质体虽无细胞壁但仍保持细胞的全能性解析：由图可知，①用纤维素酶和果胶酶处理得到原生质体的过程；②③再分化。植物组织培养时植物激素处理的不同处理：生长素与细胞分裂素比例适中时，有利于愈伤组