光谱分析四荧光分析法

光谱分析四荧光分析法第一页，共二十三页，2022年，8月28日2

第一章光谱分析

第二节荧光分析法一、概述

1、荧光光度分析法由激发态能级回到基态能级的过程中以光的形式放出多余的能量，并发射出比原波长更长的光谱，这一过程称分子发光，检测分子发射光谱的分析方法称为荧光光度分析法。第二页，共二十三页，2022年，8月28日第一章光谱分析

第二节荧光分析法一、概述2、荧光分析特点专一性强灵敏度高选择性强发光发式多可分析参数多返回

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第三页，共二十三页，2022年，8月28日4

第一章光谱分析

第二节荧光分析法二、分子发光的理论较高电子激发态振动能级以热和无辐射的形式释放能量最低第一级电子激发态振动能级以光子的形式释放能量基态分子能量吸收过程λ磷光荧光发射荧光和磷光的示意图第四页，共二十三页，2022年，8月28日5

常见的光致发光现象是荧光和磷光荧光和磷光的主要区别:

①荧光:激发光停止照射后，发光过程持续10-9-10-6s

磷光:发光过程持续10-4-10s②荧光是从最低单线激发态发出，磷光则由最低三重态能级发出。

二、分子发光的理论第一章光谱分析

第二节荧光分析法第五页，共二十三页，2022年，8月28日耗能方式

①在同一能级中分子间的相互碰撞消耗能量；②无辐射衰减转给周围分子变成振动消耗；③辐射荧光——以光子的形式释放能量；④光分解消耗分子内部的能量。6

第六页，共二十三页，2022年，8月28日分子荧光的类型物理发光指荧光分子吸收了光能而产生的荧光，称为物理发光。也称光致荧光。化学发光是指分子与分子之间的化学反应所产生的化学能，在化学反应过程中释放能量而发射荧光。也称化学荧光。生物发光通过生物体内的荧光酶与荧光物质相互作用，在生物化学反应过程中所释放出来的光能。也称生物荧光。7

第七页，共二十三页，2022年，8月28日8

激发光谱:固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，以激发光波长为横座标，荧光强度为纵座标作图，即可绘制。发射光谱:固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，将荧光的光波长为横座标，荧光强度为纵座标作图便可得到荧光光谱第一章光谱分析

第二节荧光分析法第八页，共二十三页，2022年，8月28日发射光源激发光源激发光谱波长发射光谱波长荧光分子激发光源激发光谱波长发射光谱波长荧光分子发射光源(改变波长)选择最大发射波长固定波长(改变波长)激发光谱测试示意图发射光谱测试示意图9

第九页，共二十三页，2022年，8月28日10

第十页，共二十三页，2022年，8月28日11

荧光量子产率φ分子产生荧光必须具备两个条件：

a分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光提供辐射能；b分子吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子的能力。产生荧光量子的强弱可以用荧光产率φ表示。它是荧光分子发射荧光的能为参数。（也称荧光效率或量子效率)。

第一章光谱分析

第二节荧光分析法第十一页，共二十三页，2022年，8月28日12

荧光过程的量子效率φf:

如kf>>kc和kx，φf→1。如kc或kx>>kf，则φf→

0。kf——荧光发射的速度常数；kc和kx——为其它有关速度常数的总和。第一章光谱分析

第二节荧光分析法第十二页，共二十三页，2022年，8月28日13

对低浓度溶液样品，保持一定最大发射波长和最大激发波长条件下测得荧光强度If可表示为：If=2.303I0

bcI0——为激发光强度；b——

为液池厚度；C——

为浓度；——摩尔吸光系数在一定条件下：If=Kc

荧光强度与荧光物质的浓度成之正比

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第一章光谱分析

第二节荧光分析法第十三页，共二十三页，2022年，8月28日14

荧光猝灭（荧光熄灭）：

广义的说，指任何可使物质荧光强度下降的作用，任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用，或任何可使荧光量子产率降低的作用。狭义的说，指荧光分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。荧光猝灭剂：与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质，称-。第一章光谱分析

第二节荧光分析法第十四页，共二十三页，2022年，8月28日15

三、荧光分析仪器第一章第二节荧光分析法光源激发单色器样品池吸收光谱检测器荧光分光光度示意紫外分光光度示意第十五页，共二十三页，2022年，8月28日荧光分光光度计根据发射光谱的特点设计的紫外分光光度计是根据吸收光谱设计的,二者差异主要有：测光角度不同单色器位置不同比色杯不同荧光检测器与入射光源方向成90角，对面为暗背景。紫外的检测器位置与入射光源平行。荧光计的单色器设在检测器前面，样品的发射光经单色器分光后进入检测器。紫外计单色器设在样品池前面。荧光计使用的是四面透光的样池，紫外计使用的是两面透光的样池16

第十六页，共二十三页，2022年，8月28日仪器名称：日立850型荧光分光光度计仪器型号：日立850仪器名称：PerkinElmerLS50B型发

光光谱仪仪器型号：LS50B主要技术指标：

波长范围：200-850nm；

波长精度：±1.2nm，发射狭缝：

2.5-20nm

狭缝范围：激发狭缝：2.5-15nm；

发射滤光片：290,350,390,430,

530nm（通过计算机选

择），样品池：1cm

荧光池信噪比：62：1水拉曼峰测定，

狭缝10nm）主要技术指标：

波长范围：200-900nm；

波长精度：±1.0nm；分辨率：

￡0.15nm

狭缝范围：0.15-20nm

信噪比：20：1（水拉曼峰测定，

狭缝5nm）

发射滤光片：290,350,390,430,

530nm（通过计算机选

择）样品池：1cm荧光池第十七页，共二十三页，2022年，8月28日基本功能：

(1)激发光谱、发射光谱；

(2)ms级发光寿命测定；

(3)荧光、磷光测定；

(4)液体、固体样品测定第十八页，共二十三页，2022年，8月28日19

激发光源——

作用：提供连续辐射，激发样品要求：光源（I0）强度足够；强度与波长无关种类：汞弧灯、氢灯或氙灯。激发单色器----

作用：置于光源和样品之间的为激发单色器或第一单色器,筛选出特定的激发光源。

第一章光谱分析

第二节荧光分析法第十九页，共二十三页，2022年，8月28日20

样品池——用石英制成，形状:正方形、长方形、圆形的。低温测定时在石英液槽外套一个盛放液氮的透明石英真空瓶。发射单色器——用于选择投射到检测器的荧光波长。检测器——荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高。

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第一章光谱分析

第二节荧光分析法第二十页，共二十三页，2022年，8月28日四、分析方法1、定量分析①标准曲线法同紫外可见光度计的标准曲线法②内标法在一定浓度范围内，选择一个标准样品浓度，测得值与同样条件下的未知样品值进行比较未知样品浓度（mg/mL）=（A1/A2）×CA1——未知样品的荧光发光值A2——标准样品的荧光发光值C——标准样品浓度21

第二